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2019-12-06浏览量:2183

Annual Reviews:宏基因组测序在临床病原体检测上的应用(下)

上期我们解读了mNGS病原体检测的优势、局限性、测序平台、实验和生信过程等(详情请戳此链接),接下来,我们继续来看看mNGS病原体检测的质量保证、结果验证和应用领域。

 

文献ID

英文题目:Clinical Metagenomic Next-Generation Sequencing for Pathogen Detection

中文题目:临床宏基因组测序用于病原体检测

期刊名:Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease

年份:2019    IF:13.833

通讯作者:Charles Y. Chiu

单位:加利福尼亚大学

 

宏基因组测序的质量保证

通常在一次mNGS过程中对多个临床样本一起处理和测序,并通过核苷酸标签来区分各样本。这使得可以将临床样本与对照一起测序,从而进行质量控制。


内标

加入虚拟的微生物内标(IC),内标的基因组或唯一可识别基因组核酸有助于对原样本进行定量,并可对整个过程进行质量监测。加入的内标可以是整个生物体、提取的核酸或合成的DNA、RNA序列。

 

还应考虑到IC中任何潜在的病原体污染物,因为所有样本中都将出现这种污染。例如,如果IC用的是来源于从大肠杆菌(一种人类病原体)制备的噬菌体或质粒,那么所有的样本都有可能被大肠杆菌污染,从而使临床样本检测变得复杂。

 

如果ICs之间易于区分,就可以在流程的不同步骤中加入不同ICs,使用多ICs,如加入具有唯一序列的寡核苷酸。比如在提取之前和之后在样品中加入两种唯一可识别的ICs,那么提取过程的效率就可以被精确监控。如果ICs大小已知,也可以在测序之前评估ICs是否存在,例如,如果已知IC的长度正好是100个碱基对,那么就可以将其作为毛细管电泳的标记物进行定量。如果IC有与样品基因(DNA或RNA,人类或微生物)不一样的序列,可以用定量PCR分析来量化IC。监测IC的回收率还可以用于评估病人的分析结果。

 

外标

在每次测序过程中,阳性和阴性的外标都是需要的,并作为单独的样品,使用相同量的试剂和流程进行处理。如果无法获得人体样本 (如脑脊液,CSF),可以使用合适的样本替代物,如合成脑脊液 (Golden West Biologicals, Temecula, CA)。

 

阴性对照用于监测外部或试剂微生物污染和交叉样本污染。阳性对照用于检测核酸提取、文库制备过程或生物信息学中的性能故障。通常,阳性对照包括阴性对照基底和定量的代表性病原体,包括每种待检测微生物类型(如病毒、细菌、真菌和寄生虫)中的一种。可以选择非致病性代表性微生物作为阳性对照,以减少致病性微生物交叉污染导致假阳性的风险。

 

过程控制

在mNGS过程中,可以对多个点进行过程控制,以确保在进行下一步分析之前材料的质量。这在开始测序前尤为重要,因为测序所用的试剂相对昂贵,重复测序会增加很大的成本。

 

可用各种方法对测序文库DNA定量,包括光谱法(如NanoDrop分光光度计)和定量PCR。在最后的文库制备中,核酸的数量必须足够,一个测序pool中每个样本文库的相对数量必须归一化。而使用SPRI(固相可逆固定)或AMPure (Beckman Coulter, Beverly, MA)珠子可以用来富集或排除大小在预期范围之内或之外的DNA片段,也可以对文库大小进行评估,以确定测序前文库内DNA的平均长度和分布。可以通过凝胶电泳根据长度分布来确保文库质量,例如使用Bioanalyzer analysis (Agilent, Santa Clara, CA)或Fragment Analyzer (Agilent)。

 

污染控制

微生物污染无处不在,可能存在于试剂、实验室、环境或正常的人类菌群中,由于mNGS的敏感性,即使是微量的外部污染也会出现在测序数据中。每一步过程都有可能产生污染,样品处理不仅要无菌,还要尽量减少外源性核酸的污染。mNGS使用的所有试剂和一次性用品都可能被污染,因此,记录批号和及时更换污染材料是关键。还应该在每次运行时检查阴性对照。与其他涉及指数扩增的分子检测方法(如PCR)类似,保持扩增前和扩增后的单向工作流程和严格的物理隔离至关重要。

 

第二种形式的污染是来自同一过程的其他样本,或来自高病原体含量文库的渗透或串扰。这可以通过不同的机制发生:Illumina测序过程中的标签跳跃,引物或接头合成过程中的index污染,或任何mNGS过程中的交叉污染。

 

标签跳跃是使用Illumina测序仪时可能发生的一种现象,即分配给一个样本的DNA分子唯一标签会以分配给另一个样本的标签的形式出现。最近,Illumina公司采用的排除扩增的图案化流动槽的技术使这一问题变得更加严重,该技术在更高效更经济的仪器中使用:HiSeq 3000、HiSeq 4000、HiSeq X Ten和NovaSeq。排除扩增的交叉污染程度可达10%,在敏感的应用中,如宏基因组测序,可检测出明显的假阳性。

 

双标签,插入DNA片段的两边都置上唯一的索引标签,能够减轻但不能完全消除标签跳跃带来的污染。无论何种机制,对宏基因组数据的解释应始终包括对可能的交叉污染的评估,特别是当测序时包含高水平的病原体样本时。

 

另一个污染源是在合成过程中被污染的引物或接头。当需要合成大量引物时,典型的方法是同时合成引物,这大大增加了交叉污染的风险。与高效液相色谱法一样,通过同一色谱柱纯化寡核苷酸可能会加剧交叉污染。评价新的寡核苷酸引物应包括一种评价交叉污染程度的方法,特别对相邻的板孔。因此,除了实行标准的试剂质量控制以避免污染外,每条新的引物barcode准备一个高浓度样品,并在平行分析时检查是否从其他barcode中读取到该微生物,从而对新的引物是否污染进行评判。

 

数据库质量控制

由于Genbank中基因组数据量的指数增长,数据库的不断更新,常见病原体的基因组是可以获得的,然而,对于罕见的病原体,通常只有特定的基因或基因组的有限区域被测序,严重限制了基于这些参考序列比对的检测灵敏度。因此,定期更新参考数据库是很重要的,因为添加的新的参考序列将提高宏基因组检测的敏感性。然而,如果这些新的参考序列无意中被其他物种的相应序列污染(例如,细菌的序列被错误地标注为真核生物的基因组),也有增加假阳性的风险。此外,即使是对参考数据库的微小更新也需要版本控制,并可能需要重新验证生物信息学流程,因为它们可能影响mNGS分析结果的准确性。

 

生信过程质量控制

与记录试剂批次并遵守标准操作程序类似,计算流程需要版本控制,清楚地跟踪软件包、参考数据库和使用的输入参数。与湿实验不同的是,生物信息学的运行可以使用不进行额外处理的原始数据。因此,随着生物信息学流程的发展和优化,相同的mNGS数据被多次重新分析的情况并不少见。对干实验的调整可能包括软件版本、输入参数、算法和参考数据库。维护标准化的mNGS数据集通常是有用的,这些数据集可用于对现有生物信息学流程的更改进行基准测试或比较不同流程的性能。

 

最近,分子病理学协会和美国病理学院联合推荐了NGS生物信息学流程。虽然这些建议是基于人类生殖系和体细胞突变测序分析,但几乎所有的建议都适用于宏基因组测序的生物信息学。建议对测序数据的评估应该从指标开始,比如测序reads数、每个样本的深度和reads的质量。低质量的reads可能是由于仪器故障、文库构建问题或样本降解。在一个给定的样本中,低reads数可能是由于测序样本混合不均匀、簇不均匀(如果在Illumina测序仪上运行)或对DNA定量时不准确。测序后,生物信息学分析可以为质量评估提供几个指标,包括序列质量和复杂度。对于每轮测序,用对照(内标、阴性外标和阳性外标)的结果对运行质量进行度量。

 

性能测试

与任何临床实验一样,mNGS分析也要服从实验室能力比对验证(PT)。由于没有为mNGS的PT评估的商业机构,因此需要其他的评估方法。最常见的是,先前的有或没有进行宏基因组测序的临床样本(比如感染阳性或阴性)进行盲实验重新分析,获得实验室内的PT文档。随着越来越多的实验室在更多的样品类型上进行mNGS实验,实验室间交换额外的或标准化的参考资料,将有助于评估不同实验室产生的结果。

 

在PT评估时,使用正交方法(如PCR)确认mNGS结果中是否存在微生物也是有用的。由于使用mNGS能检测到的微生物非常广泛,因此PT材料应该包含各种生物体类型。对常规检测中发现的新生物进行独立验证也是可取的,这有助于扩大mNGS检测中已知可检测物种的范围。

 

宏基因组新一代测序验证

mNGS实验验证可以分为干、湿两部分,这两部分对于确保NGS实验的安全性和准确性都很重要。可以验证或重新验证干、湿实验中的一部分,但是通常,优化实验需要同时修改两个部分。例如,如果内标改变了,那么湿实验将改变物理对照,而干实验室的需要修改算法确保新的内标可以被生物信息学流程检测到。但是,如果只改变干实验,则可以使用之前的测序数据或预先生成的标准化mNGS数据重新验证生物信息学流程。


准确度:湿实验

由于mNGS是基于“发现”的方法,而不是“假设驱动”的方法,在有目标微生物的情况下,使用mNGS检测参考数据库中所有可能的微生物是不切实际的。我们推荐一种基于NGS方法的方法,正如美国病理学院之前建议的那样。可以对代表每一类感染的微生物 (例如,DNA病毒、RNA病毒、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母、霉菌、寄生虫)进行测试,以评估准确度。首选的样本类型是来自感染患者的样本,这些样本包含待检测的微生物,但如果很难获得代表性样本,则微生物体或纯化的核酸也可以。

 

准确度:干实验

尽管GenBank中的参考序列数量庞大,但许多病原体的基因组序列仍然缺失,而且组装的参考基因组的质量水平不一致,常常包含来自其他生物体或共享质粒的核酸序列。值得注意的是,FDA正在构建一个标准化的微生物序列参考数据库 (FDA-ARGOS) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/231221)。FDA-ARGOS中的原始序列是使用严格的方法获得的,包括在两个不同平台上独立测序(比如Illumina和PacBio)以及基因组组装使用多种算法。标准化的代表性数据集的开发和使用,可用于测试不同流程的性能以及对参考数据库进行更改。

 

精确度

mNGS分析的精确度和可重复性是通过重复测序来确定的。除了最终结果的可重复性外,诸如文库和序列数据质量以及背景菌群的评估等指标也可用于监督mNGS的性能。

 

可报告范围

应定义mNGS测定中可报告的生物谱,被确定为背景污染物或临床无关紧要的生物应加以描述。类似于在肿瘤分子检测中发现新的未确定意义的变异,非典型生物的检测需要对其潜在的临床意义进行批判性评估,而临床适用性的不确定性应通过结果报告传达。使用独立的检测方法(如PCR)对新的或少见的结果进行正交验证,随着时间的推移扩大可报告微生物的类型。在这种情况下,实验室可以进行额外的后续检测,或让公共卫生实验室进行这些验证性分析。

 

参考范围

感染性疾病分子检测的参考范围通常是“未检测到的”,但对于无偏的mNGS检测,一些微生物可能作为正常菌群的一部分被检测到,甚至在无菌的样本中检测到。这些微生物中可能是由于背景污染(如人乳头瘤病毒),而另一些是真正的循环病毒血症感染,但没有已知的直接临床意义(如指环病毒和GB病毒C)。其他的包括简单的数据库错误或注释错误(例如,与细菌序列一致的病毒)。临床mNGS报告应包括已知或至少怀疑有致病潜力的生物体,而不应包括被不当认为引起疾病从而导致不适当治疗的非致病因素。

 

有些病原体是条件致病菌,需要根据患者的表现对其存在情况进行评估,以确定其临床意义。在慢性感染的个体中,人类疱疹病毒被整合到基因组中或游离存在,它们的检出可能仅仅表明在样本中存在潜伏感染的白细胞。这些病毒在临床上可能是重要的病原体,因此报告它们可能是适当的,它们的检出可能代表潜伏感染而不是激活感染。

 

检测限

通常通过对稀释的对照样本重复试验和概率元分析来确定核酸的95%置信检测限。由于每种生物类型根据提取效率和基因组片段的不同,其序列回收率可能不同,所以这些研究是使用代表性生物进行的,其结果外推到相似的生物类型。可与其他检测方法比较检测限,如培养或PCR,以确定mNGS相对于这些方法的敏感性。

 

mNGS对微生物检测的敏感性取决于该从临床样本中存在的基因组中提取和制备文库的能力。因此,相似类型的生物体在生成mNGS reads的比例上应该相似,从而可以采取一种代表性的生物体检验检测限。然而,当某些微生物被视为mNGS检测背景的一部分时,从背景中分辨出真正阳性的样本可能需要更高的微生物浓度。例如,mNGS文库中比对到Cutibacterium acnes(丙酸杆菌属)的reads常是背景样品或试剂的污染。将检测限归一化到背景水平有助于辨别阳性样本,避免误报。实现这一目标的一种方法是,用样本reads数除以阴性或无模板对照reads数,然后根据这个比值使用检测限。

 

干扰物质

与其他分子方法类似,已知的抑制核酸提取或酶活性的物质应添加到已知的阳性样本中,以确定其产生假阴性结果的可能性。常用检测的干扰物质包括血红素、蛋白质(高水平)和胆红素。对于mNGS分析,人类基因组DNA和RNA可以被认为是干扰物质,样本中的过量水平基本上掩盖了微生物核酸的存在。因此,加入外源性DNA、RNA或细胞,以测定具有高水平人类宿主核酸的样品的mNGS测定性能。如前所述,当一个个体样品中含有高水平的宿主核酸时会降低对微生物检测的敏感性,加入内标就可以有效地确定。

 

污染物

在mNGS检测过程中,每个测序都应包括阳性对照和阴性对照,以监测微生物污染。当大量使用新的商业试剂和耗材时,这一点尤其重要。阴性对照背景核酸含量应低于患者样本,以最大限度地提高检测污染物的敏感性。污染应该随着时间的推移进行跟踪和监控,调查潜在的污染来源,一旦确定,努力消除或尽量减少污染,特别是如果它来自临床意义重大的样本。如上所述,对阴性样本的mNGS结果中的背景进行归一化的方法有助于避免假阳性。

 

稳定性

患者样本以及检测过程中材料(如提取的核酸和测序文库)的储存和运输条件需要合适。利用已知的对照来评估各种类型微生物在冷藏和冷冻以及多次冻融循环后的稳定性,以确保在各种条件下的回收率。

 

宏基因组新一代测序临床应用

中枢神经系统感染

脑膜炎和脑炎的病因往往不清楚,但它们可能是由未确诊的感染引起的。潜在病原体的名单相当广泛,尽管进行各种的诊断检测,但在某些情况下,致病病原体仍未被发现。在一些病例中,无偏倚的mNGS已被用于确定病因,并使用常规检测进行诊断验证,其中一些感染已被证明对治疗有效。目前已有多个病例从脑脊液和脑组织中鉴定出病毒、细菌、真菌、寄生虫等。

 

脑脊液通常取自中枢神经系统(CNS)深处侧脑室、第三脑室和第四脑室附近的区域,是组织活检的重要原材料。最近的研究也表明,腰椎穿刺获得的脑脊液可用于检测位于脑脊液流上游并毗邻脑脊液腔的中枢神经系统肿瘤产生肿瘤特异性DNA突变。证据表明,可采用最低限度的创伤来进行CNS诊断,如腰椎穿刺。

 

血流感染

多个病例报告和初步研究表明,血液中循环或非循环病原体的无细胞病原体DNA或RNA可能与感染有关。测序可以检测正在接受抗菌治疗的高危患者的病原体DNA,增加了mNGS检测用于诊断培养阴性脓毒症患者感染的可能性。

 

呼吸道感染

肺炎是一种常见的感染,但通常都很难得到快速、准确的诊断。许多患者在没有准确诊断的情况下接受广谱抗生素治疗,这导致了一定程度的抗生素滥用。而呼吸系统中广泛存在的无害共生菌群,也使病原菌的准确鉴定更加复杂。定量或半定量统计分析可能有助于区分感染致病菌和普通共生菌群。

 

胃肠道感染

虽然已有多项研究对粪便微生物组进行了分析,但只有少数人尝试使用mNGS技术诊断相关的临床疾病,如腹泻。在急性胆囊炎患者中,无偏倚mNGS已被用来识别潜在病原体。超广谱β-内酰胺酶基因与菌的药敏性相关,说明mNGS可以用来提供病原体的抗生素耐药性相关信息。

 

眼部感染

一些研究中已经使用了mNGS对已知的和未知的眼部感染患者进行了诊断,包括慢性眼内风疹感染。与传统方法相比,mNGS应用于体积有限的眼部样本可以检测到更多的病原体。

 

总结

mNGS是一项革命性的技术,它在几个方面颠覆了传统的临床诊断。本综述阐述了这项新技术及其相关工具如何应用于微生物学临床诊断。与其他类型的临床试验类似,这些新的诊断检测方法的应用也进行着严格的临床验证,包括证明临床效用、使用指南制定、发现潜在问题等。而mNGS在病原体检测方面的应用也在各专家共识和诊断治疗指南中被认可。

 

公司介绍

公海赌船555000成立于2014年10月,是一家专业从事基因科技健康服务的国家高新技术企业。公海赌船555000依托高通量测序技术平台,专注于人体微生物组前沿技术和研究成果在基础科研领域的突破,以及在医学上的转化应用。助力高等院校、科研机构或医院的科研工作者多角度、全面地探究和解决科学问题,助力更多优质科研成果发表。同时,在大肠癌早期筛查临床病原宏基因组检测健康管理等精准医疗领域开发检测技术及应用方案,致力于为医疗机构提供疾病早期检测和健康综合管理服务,目前已和全国300多家顶级医院达成深度合作。   

 

公司于2018年获评“上海闵行十大科技创业新锐”企业称号,目前已在杭州、青岛、济南、贵阳等地成立区域中心。其中,济南医学检验所于2016年被授予“国家基因检测技术应用示范中心”称号,青岛医学检验所于2019年9月投入使用。

 

RealPathogen™病原微生物高通量测序科研合作平台和临床检测服务

RealPathogen™病原微生物高通量测序测序科研合作平台和临床检测服务,采用非培养依赖的宏基因组学二代测序技术(mNGS),使用Illumina NextSeq 500测序平台,突破临床传统方法学先假设预判的限制,直接从临床标本中提取全部微生物核酸序列(包括DNA和RNA),再与定制的病原检测数据库进行比对,通过智能化算法分析获得致病微生物的种属信息。 

 

只需一份样本,一次检测,即可同时分析多达14788种微生物,对样本中所有细菌、真菌、病毒等疑似致病微生物“一网打尽”,无偏倚精准检测微生物谱,辅助临床感染性疾病精准诊断和治疗。

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