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2019-12-03浏览量:1343

《Microbiome》警示:装运批次对大鼠尿液代谢组和肠道菌群影响高于尿毒症!

导读

啮齿动物模型对于整个生物体生物过程的研究具有极高价值。此类研究的可重复性是基于实验动物代谢的相似性,以及降低遗传和环境因素的影响。实验试图通过证明实验性尿毒症对大鼠尿代谢组和肠道微生物群的影响,结果发现装运批次的影响对大鼠尿代谢物和肠道微生物群的影响比尿毒症大。

 

文献ID

题目:Batch effect exerts a bigger influence on the rat urinary metabolome and gut microbiota than uraemia: a cautionary tale

译文:装运批次对大鼠尿液代谢组和肠道菌群的影响高于尿毒症:一个警示

发表期刊:Microbiome   IF:10.465

发表时间:2019.09.02 

发表单位:伦敦玛丽皇后大学威廉·哈维研究所转化医学与治疗中心

检索:10.1186/s40168-019-0738-y

 

 

材料与方法

实验设计

1. 实验动物

24只雄性近交系Wistar IGS大鼠,从Charles Rivers(英国肯特郡)进行两次装运。所有这些动物都在12小时光照/黑暗周期下放在单独通风的笼子里,并可以自由地获取水和食物(来自英国艾塞克斯郡的Special Diet Services的RM1饮食)。

 

经过一个星期的适应期后,对大鼠进行全肾切除术(n=14)或假手术(n=10)。手术后,每周对大鼠称重。每个笼子最多放四只大鼠。在手术第二阶段后,根据手术干预将动物圈养2周后,将尿毒症动物(全肾切除术)和对照动物组(假手术)混合喂养。分析发现混合喂养不影响尿液代谢组或肠道微生物组。每周将动物单独关在代谢笼中,收集24小时尿液样本,−80°C保存直至分析。注射硫代戊酮钠处死大鼠,取盲肠液,将其储存在箔片中,并在液氮中速冻,然后−80°C冷冻直至分析。通过心脏穿刺采集血样,离心后,将血清-80°C冷冻直至分析。

 

2. 相关实验数据获取

血清尿素和肌酐的定量由德国路德维希堡的IDEXX Bioresearch完成。尿液样本在用缓冲液稀释之前被随机分配,并在机器上运行以消除处理和分析中批次效应带来的影响,使用NMR光谱仪(布鲁克公司)进行分析。使用QIAGEN的DNeasy PowerSoil试剂盒从盲肠液样品中提取DNA,然后进行16S rRNA基因V3-V4高变区的测序。

 

测序区域及平台

16S-V3/V4高变区高通量测序    非靶向代谢组 NMR光谱仪(布鲁克公司)

 

研究成果

1、术后表型差异

全肾切除术处理组(n=14)与假手术对照组(n=10)相比,所有接受全肾切除术的动物均表现出预期的尿毒症表型,包括血清尿素和肌酐升高,体重减轻和多尿,并且不同批次的动物之间没有明显的表型差异(图1)。

 

图1.表型对比

 

2、尿液代谢组分析

通过对NMR谱图进行归一化后进行主成分分析(PCA),可以确定装运批次是代谢数据中最大的差异来源。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型发现使用装运批次建立的模型的预测能力(Q2Y=0.66,p=0.001)比使用处理类别建立的模型(Q2Y =0.48,p=0.007)强。

 

图2.主成分分析图与NMR谱图

 

依据OPLS-DA模型得出两批装运批次的差异性代谢物,并根据对齐的光谱图谱相关区域的积分计算出它们的相对丰度(表1)。第1批中的动物尿液与第2批动物相比发现,甘氨酸(141.5 vs. 68.5相对单位,Benjamini-Hochberg校正后的p<0.001),丙氨酸(29.3 vs 18.0单位,p<0.001)和葡萄糖(43.9 vs 19.7单位,p=0.006)显著增加,它们还排泄了更多的潜在肠道细菌的产物,乙酸盐(短链脂肪酸,192.2 vs 105.2单位,p=0.003),琥珀酸盐(膳食纤维消化的细菌代谢产物,97.9 vs 72.6单位,p=0.017)和乳酸(571.7 vs 188.3 单位,p=0.001)。值得注意的是,第一批的动物尿液中几乎完全没有马尿酸盐,而第二批中均检测到马尿酸盐(6.6 vs 34.5单位,p=0.003)。相应的第2组动物的尿液中苯甲酸(一种肠道微生物衍生的马尿酸盐前体)比第1组动物的尿液中的含量更低(111.0 vs 52.1单位,p<0.001)。尽管样品间的高度变化意味着批次效应未达到总体意义,但通过对单个样品的NMR谱进行分析,可以发现几乎所有批次1中的样品没有检测到的三甲胺(细菌蛋白质代谢产物),在批次2中容易检测到。

 

为了进一步证明批次的差异是否会影响尿毒症对尿液代谢组的组成,文章使用手术治疗类别(全肾切除术与假手术)为响应变量,分别为每个装运批次建立了OPLS-DA模型。发现批次1的模型是没有意义的(Q2Y =0.265,pQ2Y =0.120),这导致了潜在的结论:尿液代谢组不受尿毒症影响。但是,使用批次2获得了显著的预测模型(Q2Y =0.543,pQ2Y =0.049),尽管样本数量较少,但这仍然表明尿毒症确实决定了尿液的表型。由此可以发现批次的差异确实会导致关于尿毒症对尿液代谢组学作用的错误结论。

 

表1.尿液代谢物的标准化相对浓度

 

3、盲肠液16S扩增子测序分析

为了进一步评估批次和手术类别对肠道菌群的影响是否可能是代谢组学数据中这些趋势的基础,对从盲肠液中提取的DNA进行16S rRNA的V3和V4高变区进行测序。结果发现装运批次对样品聚类的影响大于处理类别(图3a)。同时,ADONIS分析也得出了相似的结论,确定批次对肠道微生物组的影响虽小但很明显(R2=0.097,p=0.001),而手术类别的影响却并不显著(R2=0.048,p=0.227)。通过使用装运批次作为响应变量建立有效的OPLS-DA预测模型,也进一步证实了这一结论(Q2Y=0.573,p<0.05),但在使用手术类别作为响应变量时结果不同(Q2Y=0.206,p=0.2)。

 

逆辛普森指数(40.7 vs 58.5,p=0.043,图3b)和香农指数(4.53 vs 4.81,p=0.046,图3c)证明了批次2的α-多样性高于批次1的,但是尿毒症动物和对照动物的α多样性没有差异。

 

物种组成分析结果显示所有样本的微生物群以硬壁菌门(占总读数的83.1%)和拟杆菌门(14.5%)为主(图3d)。利用ANCOM框架对不同装运批次和处理类别之间微生物组成进行分析,结果发现在OTU水平上的差异明显高于纲水平,但是在尿毒症动物和对照组动物中并未发现更高分类水平的差异。通过在OTU水平上进行进一步分析,发现低丰度的OTU在批次之间有显著差异,而尿毒症动物和对照动物之间高丰度的OTU差异显著。因此,尽管批次间有33个OTU具有显著差异(总1110个OTU),但它们仅占总序列的3.8%,而在尿毒症和对照动物间只有虽然仅有6个OTU具有显著差异,却占到总序列数的5.13%。

 

图3.盲肠液16S rRNA扩增子测序

 

通过进一步分析发现,处理差异间的6个OTU均来自于漆草科(Lachnospiraceae),其中5个来自于NK4A136组,一个来自UCG-001组。而批次差异的33个OTU来源于5个不同门中,与在第2批动物的样品中α多样性高的结果相一致,在该批动物中,30个OTU显著富集,这些OTU源于具有明显代谢潜力的细菌属,包括生产短链脂肪酸的RoseburiaButyricicoccusButyrivibrioAcetomaculum以及三类来自Proteobacteria的细菌。

 

研究结论

1. 经过全肾切除术后的大鼠均表现出尿毒症症状,并且不同批次的动物之间没有明显的表型差异。

2. 通过代谢组分析发现,批次的差异确实会导致关于尿毒症对尿液代谢组学作用的错误结论。16S扩增子测序也会得到类似假阳性结果。

3. 详细记录实验细节和合理的使用统计方法有利于正确的评估实验的可行性和结论。

 

亮点

本文研究者建议对实验动物的所有方面进行完整记录,包括研究中使用的不同批次的动物(如果这些动物来自商业供应商)的购买详细信息。此外,也应采取措施减少批次内的变化量,例如垫料等。同时也应该使用合理的统计学方法来对评估各项变量的影响,以助于来评估实验结果是否具有普遍性以及是否会得到假阳性结果

 

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