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2019-12-02浏览量:4604

NEJM重磅新文详解:宏基因组测序助力脑膜炎和脑炎临床诊断

导读

现有的诊断感染一般依赖于医生对患者病史、临床表现和影像学结果等鉴别诊断,然后进行连续的实验室检查。但由于感染性和非感染性的临床表现重叠,且对罕见病原体的诊断实验缺乏,以及如腰椎穿刺或脑活检等传统方法需要有侵入性操作使得中枢神经系统(CNS)样本的可用性和数量均受限,因此,大约有50%的患者无法及时发现,从而引起急性脑膜炎。

 

在为期1年对8家医院204例患者的研究中,通过正交实验测试证实了脑脊液(CSF)样本的宏基因组测序在诊断传染性脑膜炎和脑炎的有效性,显示出对脑脊液的宏基因组测序,有助于改善脑膜炎和脑炎的病原体诊断,并在部分病例中对医生的治疗方案有指导作用。

 

文献ID

英文题目: Clinical Metagenomic Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis

中文题目: 临床宏基因组测序诊断脑膜炎和脑炎

发表期刊: New England Journal of Medicine

见刊时间: 2019.06.13  IF: 70.67

发表单位: 加州大学旧金山分校

 

材料与方法

实验设计

1、病人选取

 

2、研究地点

 

3、临床宏基因组测序流程

测序区域及平台

测序产品:宏基因组

测序平台:Illumina SE140

 

研究成果

一、病人特征

共214人参与了研究,204人(55.4%为男性)最终完成了研究,平均年龄为39.6岁,其中46名(22.5%)患者未满18岁。这些患者主要分为仅有脑膜炎的70名(34.3%)、脑炎的130名(63.7%)和脊髓炎的4名(2.0%)。有176名患者(86.3%)出现了急性病症,而其余28名患者(13.7%)则出现了慢性疾病急性加重。大多数患者(193名,94.6%) 在加州的医院注册,其中免疫力低下患者占总数的40.7%(83名)。患者平均住院时间为27.9天(中位数17,范围1-246),其中有99名重症患者(48.5%)进入ICU。在加州大学旧金山分校(UCSF)和加州大学洛杉矶分校(UCLA)注册的重症患者(69名,47.3%)在ICU时间平均为17.8天;患者整体在30天内的死亡率为11.3%(23名)。

 

表1 204例患者的人口统计学和临床特征

*  CNS:中枢神经系统;CSF:脑脊液;HIV-1:人类免疫缺陷病毒1型;ICU:重症监护病房;IQR:四分位距和NGS:下一代测序;百分比为四舍五入值,所以总体并未均达到100%

†  症状已出现超过四周

‡  携带分流管、止疼泵、腰椎引流管等神经外科仪器的患者

§  共统计了191名患者的卡诺夫斯基健康状况量表(Karnofsky performance scale,KPS)数据,评分为0到100,分数越低患者健康功能状况越差,60到70分表示患者需要偶尔的帮助,但大多数需求能够自行解决。

¶  在加州大学旧金山分校(UCSF)和加州大学洛杉矶分校(UCLA)注册被接入ICU的患者(69名)

‖  数据不包括在其他外部医院获得早期CSF样本的患者

**  仅为加州大学旧金山分校(UCSF)患者所支付的平均总费用(110名)

††  仅为加州大学旧金山分校(UCSF)感染性诊断患者所支付的平均总费用(10名)

 

二、脑髓液宏基因组测序分析评估

50.5%的病人被病因诊断确诊(图1A),感染(27.9%)和自身免疫性(8.3%)作为最常见的诊断类别。采用复合参考标准,将正交确认的宏基因组结果与常规检测结果相结合,用于评估宏基因组检测的效果。在57名病人的58例感染中,通过宏基因组和常规检测均诊断出的有19例(33%),26例(45%)仅被常规检测诊断出,13例(22%)仅被宏基因组诊断出(表2)。

 

表2 宏基因组NGS感染诊断

*   加号表示阳性试验,减号表示阴性试验。CDC:疾病控制和预防中心;EBV:爱泼斯坦-巴尔二氏病毒;EV:肠道病毒,HEV:戊型肝炎病毒,HHV-6:人疱疹病毒6型;HSV-1:单纯疱疹病毒1型;HSV-2:单纯疱疹病毒2型;ITS:内转录间隔区;PCR:聚合酶链反应;PTLD:移植后淋巴增殖性疾病;qPCR:定量PCR;rRNA:核糖体RNA;RT-PCR:实时荧光定量PCR;SLEV St. Louis encephalitis virus:圣路易斯型脑炎病毒;UW:华盛顿大学;VZV:水痘-带状疱疹病毒。

†  肠道病毒B株

‡  病人由于肾移植而免疫受损,通过抗EBV治疗,使神经功能完全恢复

§  HHV-6-边缘性脑炎患者均接受骨髓移植治疗急性髓性白血病,并接受抗病毒剂治疗 ;HHV-6边缘性脑炎在这一人群中的发病情况得到了很好的描述

¶  这名儿童由于骨髓移植而免疫受损,有播散性念珠菌病史,脑脊液中1,3-β-D-葡聚糖水平持续升高,但脑脊液真菌呈阴性。在取脑脊液标本进行NGS检测前患者接受了多种抗菌药物(美罗培南、万古霉素、头孢吡肟和头孢曲松)和抗真菌药物(卡泊芬净、氟康唑和两性霉素B脂质体制剂)的经验性治疗

‖  这位hiv-1感染的患者患有获得性免疫缺陷综合症,CD4细胞计数为40,并根据肝脏被诊断为侵袭性EBV相关的B细胞淋巴瘤。在鉴别诊断中没有考虑到中枢神经系统(CNS)的EBV相关的B细胞淋巴瘤,直到通过宏基因组和常规检测验证才在CSF中检测到EBV

**  在获得脑脊液样本进行宏基因组NGS检测之前,患者接受8天哌拉西林-他唑巴坦加万古霉素的经验性治疗,随后32天是美罗培南加万古霉素加庆大霉素、利奈唑和氟康唑的经验性治疗

††  在获得脑脊液样本进行宏基因组检测之前,患者接受4天美罗培南的经验性治疗

‡‡  在获得脑脊液样本进行宏基因组检测之前,用头孢曲松、万古霉素和甲硝唑经验性治疗6小时。共有124个DNA序列(共1030万个)与奈瑟菌属物种一致,其中脑膜炎奈瑟菌(neisseriamanitidis)是SURPI+(基于序列的超快速病原体鉴定)鉴定出的最接近的匹配菌

§§  在获得脑脊液样本进行宏基因组检测之前,患者接受8天哌拉西林-他唑巴坦联合万古霉素的经验性治疗

¶¶  在获得脑脊液样本进行宏基因组检测之前,用头孢曲松或头孢他啶加万古霉素经验性治疗2天

‖‖ 在获取脑脊液样本进行宏基因组检测之前,患者接受美罗培南、万古霉素和阿米卡星的经验性治疗

 

总的来说,宏基因组检测出32例感染,而常规直接检测(定义为脑脊液的培养、PCR或抗原检测,不包括血清学检测或脑脊液以外的样本检测)仅检测出27例。但在脑脊液宏基因组检测为阴性的26例中,所有组织类型的常规微生物学检查均显示出了感染。

 

1.仅被宏基因组诊断为阳性的感染

仅由宏基因检测出的病毒感染包括圣路易斯型脑炎病毒、戊型肝炎病毒和无乳链球菌,这些病原体先前并未被临床医生所考虑;此外宏基因组检测还发现了一些临床常规检测呈阴性的可疑病原体(奈瑟氏菌属、皮疽诺卡菌、热带念珠菌、肺炎克雷伯氏菌、米氏链球菌、粪肠球菌)、意义不明确的微生物(免疫功能低下儿童MW多瘤病毒的纵向检测)、及与非感染性临床综合症直接相关的(EBV阳性原发性肝淋巴瘤及相关脑炎患者的EBV检测)或未经专门检测但可能通过常规检测呈阳性(两例肠道病毒性脑膜炎)的微生物。

 

2.仅被组织常规微生物检测为阳性的感染

在26例患者中,尽管所有组织类型的常规微生物学检查均显示出感染原因,但脑脊液的宏基因组检测为阴性。这些临床宏基因组呈现假阴性病例属于以下三个类别:1)单纯血清学检测确诊病例(11例感染),而常规脑脊液直接检测(如培养、PCR、抗原检测)呈阴性;2)从除脑脊液以外的其他样本中诊断出的病例(7例感染),例如脑活检;3)因脑脊液中病原体滴度低而导致宏基因组NGS阴性的病例(8例感染),常规微生物检测呈现边缘阳性或结果不一致,这一类包括牛分枝杆菌感染、结核分枝杆菌感染、新型隐球菌、痤疮丙酸杆菌、镰刀菌、金黄色葡萄球菌、巨细胞病毒、Ⅱ型单纯疱疹病毒。

 

值得注意的是,所有6种缺失的细菌和真菌病原体的reads图谱均有被检测到,但其丰度并未达到预先设定的报告阈值。另外还检测到19例病毒性感染,但这些感染在审查后被裁定为神经系统疾病的偶然事件。在3例病例(泛菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌)中,在差异检测后发现宏基因组的结果为假阳性,原因是由于来自环境或正常人类菌群的样品污染。

 

此外还发现,通常在CSF细胞计数超过200个cells/mm3,会有高宿主DNA背景,降低了宏基因组检测的敏感性(图1B)。

 

图1 宏基因组检测分析及评估

 

三、临床微生物测序委员会(Clinical Microbial Sequencing Board)

建立了临床微生物测序委员会,以审查临床环境中的宏基因组,并对补充的结果进行沟通和分析,包括菌种和菌株类型,报告低于预定阈值的潜在病原体,分析临床环境中纵向采集的样本,以及耐药性特征(图1C和图2)。在临床微生物测序委员会的讨论中,临床医生表示宏基因组的结果能给患者提供保障,支持停止不必要的经验治疗的临床决策(例如阿昔洛韦用于对疱疹病毒感染的经验报道);帮助排除合并感染(例如单独EBV检测在移植后淋巴增生性疾病或淋巴瘤合并脑炎中的应用)和适时的加快治疗(例如淋巴瘤或免疫抑制剂的化疗,包括糖皮质激素,治疗急性脱髓鞘性脑脊髓炎)以及应用于流行病学,如病毒基因分型(肠道病毒阳性病例)。

 

一些临床医生表示,希望缩短宏基因组NGS检测的周期,以增加结果在临床上可行的可能性。对鉴定的MW多瘤病毒而言,临床医生对一名免疫缺陷儿童进行了宏基因组NGS检测,结果使临床治疗更加复杂,因为目前尚不清楚检测到的病毒是否在儿童急性神经系统疾病中起致病作用。在仅由宏基因组诊断的13个病例中,临床医生指出,宏基因组的结果对其中8例(62%)具有临床效果(图1D),指导了7个病例的临床治疗(图1E)。

 

图2 追加的宏基因组NGS分析

 

研究结论

1. 8家医院为期1年204名患者的研究中,通过正交实验证实了脑脊液(CSF)样本的宏基因组测序在诊断传染性脑膜炎和脑炎的有效性;

2. 整体而言,在这个研究群体中,宏基因组检测出32例感染,而常规直接检测(定义为脑脊液的培养、PCR或抗原检测,不包括血清学检测或脑脊液以外的样本检测)仅检测出27例;

3. 在58例感染中,19例用常规检测和宏基因组方法均检测出病原体;

4. 在仅由宏基因组检测诊断出的13个病例中,8例具有临床效果,其中7例指导了临床治疗。

 

亮点

临产研究证明了脑脊液的宏基因组测序,有助于改善脑膜炎和脑炎的病原体诊断,并在部分病例中对医生的治疗方案有指导作用。

 

公司介绍

公海赌船555000成立于2014年10月,是一家专业从事基因科技健康服务的国家高新技术企业。公海赌船555000依托高通量测序技术平台,专注于人体微生物组前沿技术和研究成果在基础科研领域的突破,以及在医学上的转化应用。助力高等院校、科研机构或医院的科研工作者多角度、全面地探究和解决科学问题,助力更多优质科研成果发表。同时,在大肠癌早期筛查临床病原宏基因组检测健康管理等精准医疗领域开发检测技术及应用方案,致力于为医疗机构提供疾病早期检测和健康综合管理服务,目前已和全国300多家顶级医院达成深度合作。   

 

公司于2018年获评“上海闵行十大科技创业新锐”企业称号,目前已在杭州、青岛、济南、贵阳等地成立区域中心。其中,济南医学检验所于2016年被授予“国家基因检测技术应用示范中心”称号,青岛医学检验所于2019年9月投入使用。

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