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2019-11-27浏览量:1417

『锐帮读』如何用纯菌进行益生菌/病原菌的验证实验

导读

Cronobacter sakazakii是引起坏死性小肠结肠炎(NEC)、婴儿败血症、脑膜炎的重要病原体。一些随机的前瞻性临床试验表明,口服益生菌可以降低NEC的发病率。脆弱拟杆菌ZY-312菌株(以下称ZY-312)是本文研究者从健康婴儿粪便样本中分离得到的新型益生菌。然而,目前尚不清楚ZY-312如何保护宿主免受C. sakazakii感染的影响。为了解潜在的益生菌作用机制,本文利用体内和体外研究模型,验证了益生菌/益生菌调节菌群与受肠粘膜通透性控制的局部免疫系统之间存在交互作用。

 

文献ID

题目:Bacteroides fragilis Strain ZY-312 Defense against Cronobacter sakazakii-Induced Necrotizing Enterocolitis In Vitro and in a Neonatal Rat Model

译名:体外和新生大鼠模型中,脆弱拟杆菌ZY-312菌株对Cronobacter sakazakii诱导的坏死性小肠结肠炎的防御作用

期刊:mSystems  IF:6.519

发表时间:2019年8月

通讯作者:张其威、白杨和智发朝教授

通讯单位:南方医科大学

 

实验方法

体外实验:肠上皮细胞与细菌共培养(细菌侵染实验)

实验分为三种不同的侵染细胞方式(竞争,排除和替代),共分4组:(图1A)

1. 对照组:用1×107CFU的细菌侵染HT-29细胞(感染的多重性[MOI]为100),共培养1.5h。

2. 竞争组:1×108CFU的ZY-312和1×107CFU的C. sakazakii加入HT-29细胞培养物中,37℃共培养3h。

3. 替代组:1×107CFU的C. sakazakii与HT-29 细胞37℃共培养1.5h,然后加入1×108CFU的ZY-312。

4. 排除组:HT-29细胞先与1×108CFU的ZY-31237℃共培养1.5h,然后添加1×107CFU的C. sakazakii共培养1.5h。

 

小知识[1]:肠道细胞系,如Caco-2、HT-29、T-84和DLD-1,是人类胃肠道代表性的上皮细胞,它们起源于胃肠道肿瘤。上皮细胞系可用于Ussing chamber实验,该实验通常可以评估物质的输运和通过上皮细胞层的渗透性等特性。使用上皮细胞的模型可暴露于细菌或细菌提取物或细菌分泌的产物;但不同类型的细胞需在特定时间内生长并保持活力。

 

体内实验:C. sakazakii诱导的新生大鼠NEC模型

40只SPF新生大鼠随机分为4组:对照组、C. sakazakii组、ZY-312组和预防组(在接触C. sakazakii前用ZY-312进行预处理)。各组处理方式见图2A。最后收集大鼠粪便样本(每组n=3)、血液样本和肠道组织样本。

 

研究成果

(一)

ZY-312通过调节被感染细胞中粘蛋白(MUC2)的表达来抑制C. sakazakii对肠细胞的粘附。竞争和替代实验均显示,HT-29细胞中,ZY-312能以95%的效率(P<0.01)对抗C. sakazakii(P<0.001),说明体外细胞模型中,ZY-312对C. sakazakii有预防作用(图1B)。

 

研究ZY-312预处理对HT-29细胞分泌粘蛋白和MUC2的影响:PAS染色结果显示,C. sakazakii感染导致黏蛋白的产生普遍下调,且HT-29细胞中ZY-312预处理抑制了C. sakazakii诱导的黏蛋白降低(图1C)。免疫染色法直接检测MUC2水平,结果显示,C. sakazakii破坏了MUC2的表达,ZY-312预处理可逆转HT-29细胞中MUC2的表达(图1D)。

 

图1 ZY-312对C. sakazakii侵染HT-29细胞的影响及对肠细胞系屏障功能的影响

 

(二)

ZY-312抑制C. sakazakii诱导的Caco-2细胞单分子层中跨上皮电阻(TEER)和紧密连接蛋白表达的降低。检测ZY-312和C. sakazakii是否影响肠道屏障功能发现,C. sakazakii感染后,Caco-2细胞单分子层的TEER呈时间依赖性的下降。相比之下,ZY-312组的TEER值更稳定。在感染C. sakazakii前,将Caco-2细胞与ZY-312共培养3小时后,C. sakazakii诱导的TEER减少有所缓解,但在感染后18小时仍有所减少(图1E)。通过检测紧密连接蛋白的表达,评价ZY-312对肠细胞系上皮屏障功能的影响。免疫染色显示,ZY-312预处理可减弱C. sakazakii引起的Caco-2单分子层中ZO-1蛋白表达量的下降(图1F)。Western blot结果显示,C. sakazakii感染后,Caco-2细胞中ZO-1和occludin (OCLN)蛋白表达降低,而ZY-312组未见蛋白表达升高。与单独感染C. sakazakii的细胞相比,ZY-312预处理的Caco-2细胞中,ZO-1和occludin (OCLN)蛋白的表达增加。此外,ZY-312处理组细胞中ZO-1的表达水平(而非occludin (OCLN))高于预防组(图1G和H)。

 

(三)

ZY-312能改善新生大鼠中C. sakazakii对肠道完整性的破坏作用,减轻C. sakazakii诱导的NEC的肠炎症和临床症状。为评价C. sakazakii对体内肠屏障功能的影响,用C. sakazakii进行攻毒试验后,大鼠出现体重下降、食欲减退、腹胀、死亡等临床表现。C. sakazakii感染常导致NEC;但益生菌预处理可以改善这一状况。本研究中,C. sakazakii感染导致体重严重下降,而ZY-312治疗促进体重增加。感染C. sakazakii前应用ZY-312预处理对减轻体重有效。监测大鼠的体重变化,C. sakazakii组和预防组在第三天显示体重下降,第五天时,ZY-312组体重高于PBS组体重(P<0.05),而C. sakazakii组体重低于预防组(P<0.001)(图2B)。通过对大鼠死亡率的评估,发现C. sakazakii组大鼠在第5天开始死亡(死亡率达到60%),其他三组大鼠均未死亡(图2C)。因此,这些结果表明,ZY-312治疗能够提高大鼠的存活率,预防C. sakazakii的感染。

 

本文评估了新生大鼠肠道通透性和紧密连接蛋白ZO-1的表达水平。仅C. sakazakii感染导致了肠对4-kDa大分子荧光探针的通透性增加。数据显示,在C. sakazakii感染前使用ZY-312预处理的新生大鼠血清中异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖水平低于感染C. sakazakii的新生大鼠(图2D)。这说明,ZY-312可以预防C. sakazakii诱导的肠屏障损伤,有助于维持粘膜屏障的完整性。免疫组化染色显示,与对照组相比,ZY-312处理组回肠中ZO-1蛋白表达增加。这些数据也证实了C. sakazakii降低了新生大鼠中ZO-1蛋白的表达,而ZY-312预处理减弱了这种下调(图2E)。

 

研究还注意到,C. sakazakii感染刺激了诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的产生,而ZY-312预处理抑制了这种效应(图2F)。此外,对C. sakazakii感染动物的肠段进行组织学检查发现,肠绒毛明显缺失,中性粒细胞浸润。单独暴露于ZY-312对肠道完整性没有影响,与对照组动物相似。感染C. sakazakii前使用ZY-312处理可减少肠道损伤的发生和程度(图2G和H)。

 

图2 ZY-312对C. sakazakii诱导的NEC大鼠肠道完整性和临床症状的影响

 

(四)

ZY-312抑制C. sakazakii诱导的程序性细胞死亡(PCD)。如图3A所示,C. sakazakii感染的细胞表现出高度的程序性细胞死亡(29.2%)。虽然ZY-312暴露导致HT-29细胞程序性细胞死亡(11.8%)较对照细胞(6.8%)略有增加,但ZY-312预处理抑制了C. sakazakii诱导的程序性细胞死亡(17.2)。这些结果与荧光显微镜所捕获的图像一致(图3B)。但目前尚不清楚细胞死亡是由细胞凋亡还是细胞炎症坏死引起的。

 

凋亡相关蛋白包括caspase-3、caspase-6和Bcl-2家族。Bcl-2和Bax表达可激活caspase-3和p53,进而诱导细胞凋亡。Western blotting显示,与对照组相比,ZY-312对Bcl-2和Bax的表达无影响。如图3C所示,预处理组 caspase3和Bax蛋白水平低于C. sakazakii组。ZY-312预处理组Bcl-2蛋白水平高于C. sakazakii组。因此,ZY-312可以通过调节细胞凋亡来抑制C. sakazakii诱导的NEC(图3C和D)。

 

此外,Western blotting结果表明,C. sakazakii组NLRP3炎性小体和ASC表达水平升高,且NLRP3、caspase-1 p20、caspase-1 p10、IL-1和gasdermin D (GSDMD)的激活水平明显升高。而这些观察结果被ZY-312处理逆转(图3E和F)。值得一提的是,与对照组相比,ZY-312仅能增加ASC的表达,而C. sakazakii可提高NLRP3炎性小体通路中所有炎症介质及焦磷酸酶相关蛋白的表达水平。ZY-312可通过调节促炎反应和细胞死亡来抑制C. sakazakii诱导的NEC。

 

图3 ZY-312能减少C. sakazakii引起的炎症坏死和细胞凋亡

 

(五)

ZY-312影响新生大鼠肠道细菌群落组成。主坐标分析(PCoA)表明,每组的样品都是可以接受的。然而,在对照组和ZY-312组中,观察到个体间差异(图4A)。稀释曲线显示了各组OTUs的相对丰度(图4B)。在C. sakazakii的病例中,OTU的数量急剧减少,而在预处理组这种变化得以控制。此外,检测并显示了三个代表性物种,即变形杆菌、厚壁菌和拟杆菌的相对丰度,在C. sakazakii感染的新生大鼠中拟杆菌的丰度有所下降,在ZY-312处理组和ZY-312预处理组中,下降的水平较低(图4C)。在ZY-312预处理组中,MyroidesAcinetobacter更为常见。此外,预防组的变形杆菌、拟杆菌相对丰度降低(图4D)。采用LEfSe算法搜索C. sakazakii组与对照组大鼠间有统计学意义的差异菌群。结果发现,C. sakazakii组的变形杆菌、γ-变形杆菌、肠杆菌亚科和肠杆菌科的相对丰度明显高于对照组(图4E)。因此,ZY-312可以通过调节肠道菌群来预防C. sakazakii引起的NEC。

 

图4 ZY-312对新生大鼠肠道菌群的影响

 

讨论

本研究首次证明,ZY-312通过5个独立的过程抑制C. sakazakii感染的毒害作用(图5)。首先,ZY-312可能影响C. sakazakii诱导的NEC中肠道菌群的组成。其次,ZY-312逆转了C. sakazakii引起的紧密连接蛋白(Muc2、occludin和Zo-1)表达的下降。此外,C. sakazakii通过NLRP3/caspase-1/IL-1信号通路诱导细胞炎症坏死。C. sakazakii激活三种NLRP3炎性小体相关蛋白(caspase-1、ASC和NLRP3)。这些结果通过ZY-312处理得以逆转。此外,ZY-312逆转了caspase-3和Bax的表达增加以及Bcl-2的表达降低。也就是说,ZY-312逆转了C. sakazakii诱导的细胞凋亡。最后,C. sakazakii使IL-1β,TNF和TNF-γ的表达增加,这些影响可以通过ZY-312预处理逆转。

 

图5 ZY-312对C. sakazakii诱导的NEC的防御作用

 

亮点

本研究结合体外肠上皮细胞模型和大鼠疾病模型,共同验证了脆弱拟杆菌ZY-312菌株通过影响C. sakazakii诱导的NEC中肠道菌群的组成、抑制C. sakazakii引起的紧密连接蛋白表达下降和程序性细胞死亡(PCD),以及逆转caspase-3和Bax的表达增加等过程来抑制C. sakazakii感染的毒害作用。

 

参考文献:

[1]Von Martels J Z H , Sadaghian Sadabad M , Bourgonje A R , et al. The role of gut microbiota in health and disease: In vitro, modeling of host-microbe interactions at the aerobe-anaerobe interphase of the human gut[J]. Anaerobe, 2017, 44:3-12.

 

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