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2019-11-26浏览量:1612

『锐帮读』基于NGS的一种对人类血源性寄生虫检测方法的优化

导读

基于16S rRNA基因的靶向扩增子测序(TADS)通常被用来检测细菌等微生物。同时,这种技术也逐渐被应用在寄生虫和病原微生物整体群落的检测上,但由于一些寄生虫基因保守区域的存在,技术的发展受到了限制。18S rRNA基因在其真核宿主中也保守。基于临床样本用通用引物靶向扩增18S rRNA基因通常会导致竞争性引物和宿主DNA优先扩增的结果。来自美国疾病控制与预防中心的一个研究团队描述了一种新方法,采用一对通用引物来捕获所有血源性寄生虫,同时减少宿主18S rRNA模板并增强寄生虫18S rRNA扩增效率。在PCR扩增前,使用限制性内切酶在仅存在于宿主序列中的切割位点处消化18S rRNA基因即可实现此目的。

 

文献ID

原文标题:Restriction enzyme digestion of host DNA enhances universal detection of parasitic pathogens in blood via targeted amplicon deep sequencing

译名:宿主DNA限制性内切酶通过靶向扩增子深度测序提高了对血液中病原微生物的通用检测

杂志:Micrbiome   IF:10.465

发表时间:2018年

通讯作者:Richard S.Bradbury

单位:美国疾病控制与预防中心

 

材料与方法

样本收集

收集临床血液样本,提交至疾病预防控制中心寄生虫病处用于寄生虫感染确诊。


引物设计

利用生物信息学软件将24种原生动物、17种寄生虫和人的18S rRNA基因序列进行比对。对限制性内切酶切割位点进行信息分析,设计了18种引物,并在14种引物组合中测试了6种候选限制酶,分别针对4种原生动物和1种线虫,1种吸虫,2种绦虫。最终选择了1种引物,可扩增18S rRNA基因约200bp的区域并在1.5%琼脂糖凝胶上产生清晰可见条带。在测试的6种限制性内切酶中,当与所选引物配对时,BamHI-HF和Xmal始终保持最高程度的宿主DNA去除率。

 

通用寄生虫检测方法:将200μL的寄生虫阳性人类血液样本与感染了猫屎肠球菌的猫血液以每微升170万个寄生虫的浓度按照1:100混合。使用QIAamp DNA血液微型试剂盒提取DNA,并洗脱到50μLPCR级水中。提取后,使用Qubit 2.0荧光计和Qubit dsDNA高灵敏度测定试剂盒测定DNA浓度。然后将150ng DNA与20单位的BamHI-HF和20单位的XmaI最终混合成50μL在37°C水浴下温育2小时,用以消化DNA。将消化后的样品平均分成两等分,然后使用Monarch PCR&DNA Cleanup Kit(NEB)去除酶和缓冲液。然后将两个样品放于10μL洗脱缓冲液(NEB)中洗脱。使用Q5高保真DNA聚合酶对清洁和消化后的DNA进行PCR。

 

引物序列

Forward primer:CCGGAGAGGGAGCCTGAGA

Reverse primer:GCTGGAATTACCGCGG

 

测序平台

illumina PE250

 

研究成果

所选扩增区域仅在人宿主序列中含有BamHI和Xmal限制性酶切位点,它允许在Illumina扩增子测序之前,在PCR扩增期间切割宿主模板并减少宿主DNA的扩增(图1a)。为降低假阳性结果,仅当超过20个reads能够匹配到各自的寄生虫参考序列并且匹配到参考序列的reads数量超过移动的最大截止值时,样本才被视为阳性。

 

表1展示了每个实验样本被寄生虫的感染情况。信息分析结果表明所有相关动物的引物结合位点、扩增区域和限制性酶切位点与人靶序列具有100%的一致性(图1b)。

图1 通过限制性内切酶消化提高病原物DNA、降低宿主DNA扩增效率


表1 研究中用到的所有样本的宿主,来源,最初识别方法和Genbank号

 

TADS之后,与未经过DNA消化的样本相比,在消化的样本中观察到比对到人宿主参考序列的reads数显著减少(图2a)。经过消化处理后的样品能够特定比对到寄生虫参考序列的reads数增加了5-10倍。这些数据表明通过限制性内切酶消化可以减少宿主DNA背景干扰,提高对寄生虫DNA的检测敏感度,从而达到对血液中寄生虫的普遍检测能力。

 

限制性内切酶消化导致比对到人宿主的reads减少了50%甚至更多

为确定限制性内切酶消化对人宿主DNA背景的降低能力,使用健康志愿者捐赠的人体DNA和从3D7恶性疟原虫培养物中获得的寄生虫DNA系列稀释液。样品中含有0.2ng/µl恶性疟原虫DNA,或每微生约8600种寄生虫以及分别稀释至3,2.5,2,1.5,1,0.5和0ng/µl浓度的人DNA。分析表明,恶性疟原虫3D7在PCR扩增区域的2000bp内无BamHI/Xmal切割位点,因此所有经过消化处理后的样本都被清除掉扩增片段长度超过2000bp的序列。在未消化的样品中,80-100%的测序reads比对到人宿主参考序列,而只有0-20%的reads能够比对到恶性疟原虫基因序列中;经限制酶消化后,样品中比对到人基因组总的reads占40-50%,比对到恶性疟原虫的reads占50-60%(图2b)。

 

图2 宿主DNA的消化增加了人类血液寄生虫阳性样本中的寄生虫检测灵敏度(b图中黑柱代表猫,深灰色柱代表人,浅灰色柱代表恶性疟原虫)

 

寄生虫混合感染的检测

为探索这种方法检测混合寄生虫感染的有效性,人工生产出一系列混合了多种寄生虫血液的样本并进行分析。研究发现,相对于未消化的样本,经过消化处理后,样本中人类reads数显著下降,寄生虫reads数增加了2-15倍(图3)。说明该技术能够有效检测混合感染中的寄生虫,但由于不同18S rRNA类型之间存在竞争性扩增,可能会影响混合寄生虫群落中相对较低数量的寄生虫的检出率。

 

接下来,对一个非人为(自然)的混合疟疾感染样本进行测序,发现尽管未经消化处理的样本经过通用PCR和NGS测序后仅对恶性疟原虫显示阳性结果,但样本消化导致比对到疟原虫的reads增加了10倍以上,说明该技术能够对这种混合寄生虫群落进行更准确评估。

 

图3 限制性内切酶消化增强了对混合寄生虫感染的检测灵敏度

 

限制性内切酶消化显著提高了检测结果的灵敏度

为了精确该方法对病原虫含量的检测下限(LOD),使用寄生虫病率为3.3%(每微升约144,000个寄生虫)的诺氏疟原虫感染的猕猴血。将三等份样品用无寄生虫感染的人血连续稀释至每微升仅含0.072个寄生虫,并进行分析。对于扩增区域,猕猴和人的18S rRNA靶标序列是相同的。因此,尽管宿主不同,样品消化能力也是等效的。研究发现,未进行酶消化的样品的LOD很高,每微升寄生虫数在72-720时,reads开始低于基线。然而先前经过酶消化的样品,每微升含寄生虫数在7.2-72之间时,reads才开始低于基线(图4a)。

 

将趋势线拟合到对数转换的数据,以确定酶消化之前和之后的更精确的LOD(图4b)。使用该趋势线,将未消化样品的LOD外推至每微升163个寄生虫,而消化后样品的LOD估计为每微升15个寄生虫。由于此估值不是从经验数据中推断出来的,因此进行了一系列更精细的稀释(每微升寄生虫数在61.2至0.72之间)以建立更精确的LOD(图4c)。通过限制性内切酶消化,证实该测定法的LOD可低至每微升7.2个诺氏疟原虫。但是三份样本中只有两份达到了该LOD,而第三份重复样本的LOD值仅到每微升28.8个寄生虫(表2)。基于上述数据,血液样本经限制性内切酶消化后,LOD改善了1.4到8.5倍。

 

图4 限制性内切酶消化显著降低了检测结果的分析限制(灰色:未经消化样本  黑色:消化后样本)

 

表2 经限制性内切酶消化后的血液样本的诺氏疟原虫检测

 

研究结论

1、该方法为研究人类宿主中的寄生虫群落提供了一种通用且广谱的检测方法。通过使用靶向宿主特异性切割位点的限制性内切酶,选择性地限制不需要的宿主DNA序列的扩增并减少宿主18S rRNA的竞争性PCR扩增,可以提高检测灵敏度。

2、该方法已经过生物学验证,可用于16种人类血源性寄生虫的检测。

3、这种检测方法仍需进一步地探索和优化,以研究寄生虫多样性以及其他真核宿主和样本基质(如组织和粪便)中的寄生虫病。

 

公司介绍

公海赌船555000成立于2014年10月,是一家专业从事基因科技健康服务的国家高新技术企业。公海赌船555000依托高通量测序技术平台,专注于人体微生物组前沿技术和研究成果在基础科研领域的突破,以及在医学上的转化应用。助力高等院校、科研机构或医院的科研工作者多角度、全面地探究和解决科学问题,助力更多优质科研成果发表。同时,在大肠癌早期筛查临床病原宏基因组检测健康管理等精准医疗领域开发检测技术及应用方案,致力于为医疗机构提供疾病早期检测和健康综合管理服务,目前已和全国300多家顶级医院达成深度合作。   

 

公司于2018年获评“上海闵行十大科技创业新锐”企业称号,目前已在杭州、青岛、济南、贵阳等地成立区域中心。其中,济南医学检验所于2016年被授予“国家基因检测技术应用示范中心”称号,青岛医学检验所于2019年9月投入使用。

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