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2019-09-09浏览量:2458

『锐帮读』胶囊式粪菌移植后持久长期的细菌植入治疗艰难梭菌感染

导读

抗生素的使用会导致肠道微生物群定殖阻力降低并且可导致艰难梭菌(Clostridium difficile)感染,这使得在过去的20年中,艰难梭菌感染的发病率和死亡率都有所上升,给卫生保健系统造成了巨大负担。特别是,复发性艰难梭菌感染(rCDI)是一个重要的临床问题,并且发病率仍在继续增加。粪菌移植(FMT)是一种在抗生素引起的损伤后恢复正常肠道微生物群落结构的方法,现已成为治疗rCDI的标准抢救疗法。

 

此外,粪便微生物制剂可被封装,以方便给药,胶囊递送(cFMT)在随机临床试验中显示出与结肠镜给药相似的临床结果,然而通过胶囊递送微生物群会导致微生物群组成的间断变化,需要数周才能在分类学上类似于供体样肠道微生物群落,此外粪菌移植后微生物群的稳定性仍存在相当大的不确定性。这引起了人们对后FMT菌群的稳定和恢复能力的担忧观察。虽然此前已经观察到供体细菌移植在2个月的随访时间点内是稳定的,但迄今尚未评估持续的长期移植的效果。因此,本研究的目的是评估一部分患者的长期(超过1年)植入后的效果,观察这些患者是否对cFMT有反应而不再复发艰难梭菌感染。

 

文献ID

题目:Durable Long-Term Bacterial Engraftment followingEncapsulated Fecal Microbiota Transplantation To Treat Clostridium difficile Infection

译文:胶囊式粪菌移植后持久长期的细菌植入治疗艰难梭菌感染

发表期刊:MBIO   IF:6.747

发表时间:2019.7.23

主要作者:Alexander Khoruts, Michael J. Sadowsky

发表单位:美国微生物协会

 

小科普

艰难梭菌Clostridium difficile,是梭菌属的一种专性厌氧菌,对氧十分敏感,很难分离培养。本菌对氨苄西林、头孢菌素、林可霉素、克林霉素、红霉素、四环素耐药。长期使用这些抗生素,尤其是克林霉素,容易引起菌群失调,使耐药的艰难梭菌被药物选择出后大量繁殖而致病。

 

粪菌移植(FMT),属于菌群移植技术中的一种,为重建肠道菌群的有效手段,实现肠道及肠道外疾病的治疗,并被认为是近年的突破性医学进展。

 

材料与方法

实验设计

1. 健康粪便的来源(供体6,41,44)

均由明尼苏达大学机构审查委员会批准,排除标准包括传染病,代谢和自身免疫测试,胃肠道疾病或手术史、食物不耐症或过敏史、神经或精神疾病史,或6个月内的抗生素接触史(项目中的所有捐助者3年内均无抗生素接触史)。项目中所有捐助者的体重指数≤25 kg m−2。卫生保健工作者被排除在捐赠者计划之外,因为可能存在多种抗药性生物体定植的风险。检测粪便中是否有病毒、细菌和寄生的肠道病原体,以及耐万古霉素的肠球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、耐碳青霉烯类肠杆菌,以及超广谱β-内酰胺酶的细菌。

 

2. 胶囊制备

通过在N2气下混合将粪便样品均质化,筛分以除去>0.25mm的大颗粒,用5%海藻糖修正,并冷冻干燥。胶囊在分配给患者之前储存在-80℃。从供体6接受胶囊的患者服用四粒胶囊,一次代表5×1011个细胞的剂量;从供体41接受胶囊的患者服用两粒胶囊,一次代表剂量为2.1×1011细胞;从供体44接受胶囊的患者一次服用四粒胶囊,剂量为2.5×1011。此前有报道供体和剂量的差异不会影响cFMT功效。

 

3. 患者和样本来源

所有患者都提供说明材料并到了明尼苏达大学机构审查委员会的批准。患者先前至少有两次rCDI复发并且在治疗前至少3个月通过PCR检测到艰难梭菌毒素阳性,患者口服万古霉素至cFMT前2天。胶囊由研究协调员送至家,空腹服用,随后2小时内只饮用清液。期间患者与研究和临床工作人员保持密切联系,临床出现腹泻症状或毒素PCR反应呈现阳性则视为复发。复发后患者可选择胶囊或者结肠镜粪菌移植。

 

在一次性卫生帽中收集粪便样本,患者将一份小份(勺)转移到30毫升聚苯乙烯粪便样本容器中。样品储存在患者的冰箱中,然后在冰上转移到实验室,在那里将样品保持在-20至-80℃直至DNA提取。样品采集时间为粪菌移植前和MT后2至6 天,7至21 天,28至45 天,86至134 天和346至409 天。

 

其中9个接受6号供体的胶囊,10个接受41号供体的胶囊,1个接受44号供体的胶囊。一名接受6号供体和一名41号供体胶囊的患者,在最初的cFMT后感染复发,并被排除在下游分析之外。

 

测序区域及平台

16S rRNA V5-V6区,Illumina Miseq 测序平台

 

研究成果

1、微生物群落的多样性和组成

cFMT后,患者样本的多样性和微生物群落组成逐渐增加,第一周后恢复到类似于供体的微生物状态。所有样本的平均goods_coverage估计为99.0%±0.6%。通过使用Shannon指数表征的α多样性发现,其多样性在cFMT之前明显较低,而在cFMT后的2到6天显著增加(P=0.001,图1A),在cFMT后的第一周,α多样性恢复到与供体样本中相似的水平,并且在整年中保持不变。微生物群落组成与α多样性类似,cFMT前的样本微生物群落组成显著不同(R=0.18〜0.85,P<0.001),而在cFMT之后的2到6天群落组成发生显著改变(R=0.18,P<0.001;图1B)。微生物群落组成变化主要体现在梭杆菌属(Fusobacterium)和乳杆菌属(Lactobacillus)减少,拟杆菌属(Bacteroides)、Blautia、副杆菌属(Parabacteroides)、罗斯氏菌属(Roseburia)和粪杆菌属(Faecalibacterium)相对丰度增加(图1C)。

 

 

图1.供体和患者样品的微生物多样性和组成

 

2、微生物植入后持续时间观察

通过SourceTracker得到图2(用于测量菌群植入),可以发现进行cFMT后的2-6天到28-45天植入百分比显著增加(P=0.02),当所有三个供体被指定为组合供体时,与个体供体样品相比有着更大的相似性(P<0.0001;图2A)。

 

大多数患者(61.1%,11名患者)在cFMT后第一周显示供体相似性增加,并且供体相似性的程度在全年保持相对稳定(图2B)。稍少的一组患者(22.2%,4名患者)在第一个月显示供体相似性增加,随后在年底急剧下降(从最大相似性下降≥20%)(图2C))。少数患者(16.7%,3名患者)经历缓慢发生的低植入水平(<50%供体相似性),在1年样本中达到最大相似性(图2D)。无论植入模式如何,没有患者出现rCDI或胃肠道症状(如腹泻)的自发复发。

图2.评估患者样本中的供体植入情况


为了验证SourceTracker结果,还使用供体6或41与患者样品之间的OTU丰度来确定供体相似性,虽然接受来自任一供体的胶囊的所有患者样本中属于共有OTU的序列的百分比显著大于通过SourceTracker确定的供体植入(P<0.0001),但两种分析方法的结果高度相关(ρ=0.837,P<0.0001,图3)。


图3.验证SourceTracker结果(虚线为SourceTracker预测结果)

 

3、分类学特征评估

研究发现,不同的供体批次制备的胶囊在年终时并没有显著影响患者的植入比例(P=0.559)。然而,通过主成分分析发现,在cFMT的一个月后患者的微生物群落显示出与供体个体的相似组成,并且与接受其他的供体胶囊的患者有显著的差异(R=0.38,P<0.001;图4)。

 

图4.主成分分析

 

随后,基于上节提到的三种不同植入模式差异,研究进行了进一步的观察。具有持续性植入性效果的患者在cFMT后的2-6天出现了早期的拟杆菌属(Bacteroides)峰值,然而其随后的时间点显示出患者间的巨大差异(图5A),但是在随后一年中,其优势菌属仍然均保持相对丰度整体上的稳定。与供体相似度下降的那些患者则可以发现,这种相似度的下降与拟杆菌属(Bacteroides)和副杆菌属(Parabacteroides)(两者均为拟杆菌门)的下降相对应(图5B)。而通过缓慢植入的患者可以得到类似结果,缓慢植入的增加与拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度增加相关(图5C)。

 

图5.以植入模式分组的微生物群落组成和多样性

 

接下来,研究对所有样品进行Spearman相关分析进一步揭示了拟杆菌属(Bacteroides), 副杆菌属(Parabacteroides),粪杆菌属(Faecalibacterium)的相对丰度与供体相似度百分比之间存在显著正相关(Spearman ρ=0.237,0.373和0.239; P=1.0×10-4至1.7×10-2)。然而,在同一时间点,两种植入模式模式间的相对丰度差异不显著(P>0.05),同样,在一年时间点的α多样性的差异也并没有显著各组之间不同(P≥0.464)。

 

用寡核苷酸分析法进一步研究了拟杆菌属成员的种群水平变化。该分析使用16S rRNA的单核苷酸多态性来识别目标属内的可能菌株,提供比OTU聚类更高的分辨率。在所有样品中观察到16种寡核苷酸,在供体6和41的样品中观察到10种寡核苷酸,在供体44的样品中观察到6种寡核苷酸(图6)。在检测到拟杆菌的所有样品中,供体样品含有比患者更多,通常情况下,cFMT后患者样本中的多样性扩大,而丰度的变化与患者整体的模式呈现对应关系。

 

图6.持续植入患者中的拟杆菌寡型(仅单一植入型展示)

 

研究结论

1. 纳入18名接受口服胶囊粪菌移植(cFMT)后恢复健康的艰难梭菌感染患者。

2. 61%的患者在cFMT后一周即呈现高水平的供体细菌植入,其菌群与供体的相似性≥70%,可持续一年;22%的患者在治疗1个月后供体细菌植入水平降低;17%的患者中供体细菌植入发生延迟且水平较低。

3. cFMT后患者菌群与供体的相似程度,与拟杆菌属、副拟杆菌属和粪杆菌属的相对丰度显著正相关,cFMT后一年,患者间的菌群组成依供体不同而呈现显著差异。

 

亮点

1. 证明了口服胶囊粪菌移植(cFMT)在艰难梭菌感染的治疗中是有效的,且超过半数的患者一周后即会呈现高水平供体细菌植入。

2. 评估了一部分患者的长期(超过1年)植入后的效果。

 

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