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2019-08-29浏览量:2226

『锐帮读』肠道微生物-胆汁酸-IL22轴调控多囊卵巢综合征发病

导读

多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome, PCOS)是一种临床表现高度异质性的内分泌代谢紊乱症候群,是育龄妇女无排卵性不孕最主要的原因,以高雄、排卵异常和卵巢多囊样改变为特征,常伴发胰岛素抵抗。其发病机制仍不清楚,缺乏病因学治疗手段。该研究从上述临床问题出发,以肠道菌代谢产物调控机体肠道免疫的机制研究为切入点,深入探讨肠道菌—胆汁酸—IL22轴在PCOS发病中的关键作用。阐明了肠道菌与胆汁酸调控肠道ILC3细胞分泌IL-22的新机制,为防治PCOS提供了新视角。

 

文献ID

题目:Gut microbiota-bile acid-interleukin 22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome

译名:肠道微生物-胆汁酸-IL22轴调控多囊卵巢综合征发病

期刊:Nature Medicine       IF:30.641

发表时间:2019年7月22日

通讯作者:乔杰院士、姜长涛研究员、庞艳莉副研究员

通讯单位:北京大学第三医院、北京大学医学部基础医学院

 

研究策略

宏基因组测序、胆汁酸代谢组学检测、粪菌移植、组织形态学检查、RT-PCR等

 

研究成果

1. PCOS患者临床指标、肠道菌群宏基因组检测和胆汁酸代谢组研究

为了研究多囊卵巢综合征(PCOS)患者肠道微生物群落结构的变化,招募了43名健康对照供体和50名PCOS患者(为了减少肥胖对PCOS患者肠道微生物群和胆汁酸分布的影响,纳入研究的对照供体和PCOS患者的体重指数相匹配,且两组的年龄和腰臀比没有差异)。与健康对照组相比,PCOS患者有显著较高的多毛症得分(Ferriman-Gallwey分数)、血清促黄体激素水平、促黄体激素、促卵泡激素(FSH)比率、睾丸激素水平、雄烯二酮水平、游离雄激素指数、脱氢表雄酮(DHEA)硫酸盐水平、甘油三酸酯水平和低密度脂蛋白胆固醇水平、以及较低水平的血清FSH、性激素结合球蛋白(SHBG)和高密度脂蛋白胆固醇。PCOS女性空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数(胰岛素抵抗的稳态模型评估,HOMA-IR)显著升高。

 

宏基因组测序显示PCOS患者和健康对照组之间的细菌alpha多样性没有显著差异;但与健康对照组相比,PCOS菌群的beta多样性显著下降,表明PCOS个体间的群落结构更加均匀。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)表明,PCOS患者与健康对照组的样本之间存在明显的聚类模式(图1a)。肠道微生物群的投影重要性(VIP)评分表明,B. vulgatus对群体分离的贡献显著(图1b)。此外,与健康对照组相比,PCOS患者中B. vulgatus的丰度显著增加(图1c)。

 

肠道微生物群通过与宿主信号通路相互作用参与宿主代谢,KEGG分析表明胆汁酸代谢是影响PCOS患者肠道菌群变化的关键代谢途径之一(图1d)。胆汁酸种类的定性和定量分析表明,PCOS组的甘氨酸脱氧胆酸(GDCA)和牛磺酸脱氧胆酸(TUDCA)在粪便和血清中均明显低于对照组(图1e,f)。B. vulgatus与胆汁酸水平的相关分析表明,B. vulgatus与GDCA、TUDCA呈负相关(图1g,h)。有趣的是,B. vulgatus能够解偶联肝脏中合成的共轭胆汁酸。与对照组相比,PCOS患者中B. vulgatus物种表达的胆汁盐水解酶(bsh,编码胆盐水解酶的)基因丰度显著增加(图1i)。这些数据表明,B. vulgatus在PCOS女性肠道菌群中上调最为显著,进而影响了这些宿主体内GDCA和TUDCA的代谢。

 

图1 PCOS患者肠道微生物群和胆汁酸的分析

 

2. 肠道微生物群对宿主PCOS表型的影响研究

为了研究肠道微生物群对宿主PCOS表型的影响,通过口服强饲法将来自健康对照或PCOS患者粪便移植到小鼠中。与健康对照粪便移植小鼠相比,通过葡萄糖耐量试验(GTT)、胰岛素耐量试验(ITT)和HOMA-IR(图2a,b),结果发现PCOS患者粪便移植的小鼠表现出胰岛素抵抗(2b-f)和发情周期中断(图2c,d)。健康对照粪便菌群移植小鼠卵巢由不同发育阶段的卵泡组成,黄体数量正常。然而,PCOS患者粪便移植小鼠卵巢中,囊样卵泡数量增加、黄体减少(图2e)、睾酮和促黄体激素水平升高,未观察到雌二醇水平的差异。通过计算交配后第一窝中幼崽数量来进行生育能力测试,与健康对照粪便移植小鼠相比,PCOS患者粪便移植小鼠的幼仔数量减少(图2f)。

 

为了进一步确定B. vulgatus在PCOS表型发病机理中的作用,通过口服强饲法将B. vulgatus灌胃给野生型受体小鼠,并且灌胃热灭活的B. vulgatus作为对照;处理建立的PCOS样小鼠模型,用于评估B. vulgatus对PCOS发病机理的影响。结果发现,用B. vulgatus灌胃后,诱导受体小鼠发生胰岛素抵抗(图2g,h)并破坏发情周期(图2i,j)、卵巢形态学(图2k)和激素谱。这些数据表明,在PCOS小鼠模型中,富含B. vulgatus的PCOS患者肠道微生物群能够调节胰岛素抗性和卵巢功能障碍。

 

肠道微生物群及其代谢产物可能通过其对免疫系统的影响而促进葡萄糖稳态。因此,我们筛选了小鼠小肠胆汁酸和免疫细胞。与人类不同,小鼠优先将胆汁酸与牛磺酸结合,而人类主要使用甘氨酸。在B. vulgatus或PCOS患者粪便移植小鼠肠道中的TUDCA水平显著降低(图2l);对肠道免疫细胞产生的Il22IfngIl10Il13Il17aIl17fIl18Il1bIl2Il23Tnfa的mRNA相对表达量进行定量检测,结果发现,用B. vulgatus口服强饲后,这些细胞因子的mRNA相对表达量,较对照组降低约90%(图2m)。同样,PCOS患者粪便移植小鼠肠道中Il22的mRNA相对表达量显著降低。在PCOS样小鼠模型中血清白细胞介素-22(IL-22)水平也降低(图2n)。且与小鼠实验数据一致,多囊卵巢综合征患者血清和卵泡液中IL-22水平明显低于对照组(图2o,p)。

 

为了进一步鉴定产生IL-22的细胞,采用流式细胞术检测来自小肠固有层(siLP)的第3组先天性淋巴样细胞(ILC3)。B. vulgatus组的siLP来源的CD45+谱系-视黄酸相关的孤儿受体-γT(RORγT)+ ILC3中IL-22+细胞的百分比明显低于对照组(图2q,r)。这些结果表明,PCOS患者的肠道微生物群,尤其是B. vulgatus,可以调节受体小鼠的胆汁酸谱并降低ILC3-产生的IL-22水平。

 

图2 PCOS粪便菌群或B. vulgatus移植对胰岛素敏感性、卵巢功能、胆汁酸谱和IL-22产生的影响

 

3. IL-22和GDCA对PCOS样小鼠模型葡萄糖代谢和卵巢功能的影响

接下来,我们在PCOS样小鼠模型中检测了IL-22和GDCA对葡萄糖代谢和卵巢功能的影响。我们发现对B. vulgatus处理小鼠给药IL-22或GDCA会降低胰岛素抵抗(图3a,b),且基本上逆转了破坏的动情周期(图3c,d)、卵巢的形态变化(图3e-g)、激素异常(图3h,i)和第一胎幼崽数量的下降(图3j)。因此,IL-22和GDCA被证实在对B. vulgatus处理小鼠导致的胰岛素抵抗、卵巢功能障碍和小鼠不孕症的治疗中发挥作用。最近报道了产前抗苗勒管激素(PAMH)给药小鼠模型具有与PCOS患者相似的神经内分泌特征。在PAMH给药模型中,IL-22可恢复受损的动情周期、卵巢形态学、激素和幼崽数量(图3k-r)。

 

为了探讨IL-22对B. vulgatus处理PCOS小鼠可能的预防作用,同时进行IL-22给药与B. vulgatus灌胃处理小鼠,结果发现使用IL-22可预防B. vulgatus灌胃引起的胰岛素抵抗、动情周期受损、MII卵母细胞和胚胎数量的减少、纺锤体扭曲以及卵巢形态异常。这些数据表明,IL-22给药改善了PCOS样小鼠模型中的胰岛素抵抗和不育症。

 

图3 IL-22或胆汁酸可改善PCOS小鼠的胰岛素抵抗、卵巢功能障碍和不孕

 

4. 胆汁酸对IL-22分泌的调节作用探讨

为探讨胆汁酸对IL-22分泌的调节作用,采用TUDCA或GDCA对siLPs 来源的ILC3s进行分类、培养和处理。结果发现,在TUDCA或GDCA存在的情况下,培养的ILC3s分泌IL-22蛋白和Il22 mRNA 水平显著增加(图4a,b)。TUDCA口服灌胃小鼠也证实了这一发现,结果显示TUDCA给药增强了肠道的Il22 mRNA 水平和siLP中CD45+谱系-RORγ45+ ILC3s中IL-22+细胞的百分比(图4c,d)。与该发现一致,给药GDCA可上调DHEA处理的小鼠肠道Il22和血清IL-22表达水平。值得注意的是,敲除Il22受体(DHEA处理野生型小鼠)后,GDCA改善的胰岛素抗性和卵巢功能破坏有益作用被逆转。这些数据表明胆汁酸参与调节IL-22的产生,从而影响PCOS中的卵巢功能和胰岛素敏感性。

 

为了确定胆汁酸调节IL-22表达的分子机制,我们将TGR5(一种G蛋白偶联胆汁酸受体)的拮抗剂三氨喋呤给药于体外培养的ILC3s,结果发现用GDCA处理的ILC3产生的IL-22被三氨喋呤阻断;由胆汁酸增强的GATA结合蛋白3(GATA3)的表达(GATA3的表达对于ILC3亚群的稳态、发育和功能以及IL-22的产生至关重要)也被三氨喋呤阻断(图4e)。为了进一步验证该途径,我们测定了GDCA处理的小鼠小鼠体内的GATA3水平。与体外实验数据一致,GDCA处理可诱导肠中GATA3 mRNA水平增加(图4f)。结果发现用PCOS粪便或B. vulgatus处理小鼠肠道中GATA3水平降低(图4g,h)。环腺苷单磷酸(cAMP)是胆汁酸受体的关键下游信号分子,具有增强GATA3活性的作用。用B. vulgatus处理小鼠肠道内cAMP水平显着降低。令人信服的是,使用Tgr5/小鼠阻断这一通路显著降低了GDCA处理小鼠体内ILC3s分泌的IL-22增强。这些数据均表明,GATA3信号传导途径参与胆汁酸介导的IL-22生成调控。

 

5. 探讨IL-22在PCOS中调控卵巢功能和胰岛素抵抗的可能机制

白色脂肪组织褐变增加代谢率,改善胰岛素抵抗。棕色脂肪组织移植可逆转PCOS大鼠的无排卵、多囊卵巢、胰岛素抵抗和不孕症,为了探讨IL-22在PCOS中调控卵巢功能和胰岛素抵抗的可能机制,在PCOS小鼠的皮下和棕色脂肪组织中检测产热标记物。与对照组相比,PCOS粪便移植小鼠皮下脂肪和棕色脂肪中的Ucp1Pgc1aCited1Cox8b mrna水平明显降低(图4i)。在B. vulgatus处理的小鼠中也观察到类似的结果(即脂肪组织褐变减少),皮下和棕色脂肪组织中的产热标记物减少(图4j),脂肪组织内的多房细胞减少(图4k)和皮下脂肪组织中UCP1的表达降低(图4l)。值得注意的是,GDCA或IL-22给药后,B. vulgatus处理小鼠皮下脂肪和棕色脂肪中Ucp1和Pgc1a mRNA的相对表达量显著升高(图4m)。

 

6. IL-22在卵巢颗粒细胞中抗炎作用探讨

炎症在PCOS的发病机制中发挥着重要作用。为探讨IL-22在颗粒细胞中是否具有抗炎作用,体外分离人黄体化颗粒细胞并与IL-22一起进行体外培养。给药IL-22可显著逆转PCOS个体中颗粒细胞中CCL2、CCL20和IL1B mRNA的高表达(图4n)。与该发现一致,IL-22给药降低了CCL2,CCL20和IL-1β的分泌(图40-q)。信号转导和转录激活因子3(STAT3)是IL-22受体20的关键下游分子,STAT3激活其下游分子腺苷单磷酸激酶(cAMP),抑制巨噬细胞的炎症反应。进一步的研究需要验证STAT3-腺苷单磷酸活化蛋白激酶通路是否介导IL-22诱导的PCOS颗粒细胞炎症抑制。我们的数据表明,与PCOS相关的IL-22调节的胰岛素抵抗和卵巢功能障碍改善的机制可能涉及脂肪组织褐变和对卵巢颗粒细胞的直接作用以抑制炎症。

 

图4 胆汁酸-GATA3途径调节的IL-22改善了PCOS样小鼠的胰岛素抵抗和卵巢功能障碍

 

不孕症和代谢综合征是PCOS患者的主要问题,由于对相关机制了解不足,针对多囊卵巢综合征患者的不孕症和胰岛素抵抗的病因特异性治疗选择有限。这些数据有助于阐明胆汁酸和IL-22在肠道微生物诱导的多囊卵巢综合征胰岛素抵抗和卵巢功能障碍中的作用(图4r)。值得注意的是,PCOS患者的B. vulgatus丰度显着增加。B. vulgatus处理的野生型小鼠引发的卵巢功能紊乱和胰岛素抵抗加重的现象,与移植PCOS患者和PAMH处理小鼠模型的粪便样本造模相似。这一发现表明,调节肠道微生物群、胆汁酸和IL-22对PCOS的治疗具有重要价值。

 

研究结论

1. 多囊卵巢综合征(PCOS)患者肠道菌群中普通拟杆菌(B. vulgatus)增多,是导致PCOS患者肠道菌群异常的首要因素,肠道菌代谢产物胆汁酸——甘氨脱氧胆酸(GDCA)与牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的水平明显降低,并与B. vulgatus丰度呈负相关关系。

2. PCOS患者的肠道菌移植或者给予B. vulgatus菌种重塑小鼠肠道菌群后,呈现PCOS样表型,且伴随着肠道免疫因子IL-22的水平下降。

3. 给予PCOS样小鼠胆汁酸GDCA或IL-22治疗后,可显著改善激素异常、动情周期紊乱、卵巢多囊样变、生育力下降与胰岛素抵抗。

4. 机制研究揭示胆汁酸通过激活肠道3型固有淋巴细胞(ILC3)的GATA3通路刺激IL-22分泌,进一步促进白色脂肪棕色化以及抑制卵巢局部炎症,进而改善PCOS样表型。

 

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