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2019-07-19浏览量:1499

『锐帮读』深度挖掘通过脑肠轴对帕金森治疗产生影响的肠道菌及其对应基因

左旋多巴(Levodopa)可用来治疗帕金森,本身无药理活性,需要进入大脑中枢,经芳香氨基酸脱羧酶(AADC)作用转化成神经递质多巴胺而发挥药理作用。胃肠道也是左旋多巴脱羧反应的主要场所,但是在外围产生的多巴胺不能穿过血脑屏障,且会导致副作用,因此,左旋多巴要与阻断外围代谢的药物(比如AADC抑制剂卡比多巴)共同使用。尽管使用这些药物,仍有高达56%的左旋多巴不能到达大脑,并且左旋多巴治疗帕金森病的疗效和副作用在不同的帕金森患者中是极不均衡的,而且这种差异不能完全由个体代谢的差异来解释。先前的研究证明肠道菌可以代谢左旋多巴,主要途径包括左旋多巴的初始脱羧反应,转化为多巴胺,然后通过脱羟基反应将多巴胺转化为m-酪胺(图1A)。虽然知道了这些代谢反应发生在肠道微生物中,但具体的菌、基因和酶是未知的,抑制剂比如卡比多巴(carbidopa)对肠道微生物左旋多巴代谢的影响也不清楚。本文阐明肠道微生物对左旋多巴胺和多巴胺代谢的分子基础,以了解肠道微生物群对帕金森病治疗作用。

 

文献ID

题目:Discovery and inhibition of an interspecies gut bacterial pathway for Levodopa metabolism

译文:肠道微生物对左旋多巴的种间代谢及代谢抑制

期刊名:Science    IF:41.037

年份:2019

通讯作者:Emily P. Balskus, Peter J. Turnbaugh

单位:哈佛大学、加利福尼亚大学

DOI: 10.1126/science.aau6323

 

研究成果

1、人肠道菌Enterococcus faecalis对左旋多巴有脱羧作用

首先鉴定含有编码候选左旋多巴脱羧酶基因的菌,由于之前有报道:来源于Lactobacillus brevis CGMCC 1.2028菌的PLP(pyridoxal-5-phosphate)依赖的酪氨酸脱羧酶(TyrDC)在体外对左旋多巴具有活性。通过BLASTP在NCBI上搜索人体微生物组项目(HMP)参考基因中与TyrDC同源的序列,主要在Enterococcus中鉴定出来,另外还包括lactobacilliProteobacteria(图1B)。选择了10株含有TyrDC同源序列的肠道菌,测试它们在无氧条件下对左旋多巴的脱羧能力,发现Enterococcus faecalis的所有菌株都有完全的脱羧能力(图1C)。所有的E. faecalis具有保守的4基因tyrDC操纵子,这种高保守的序列与所有E. faecalis具有相同的脱羧作用表型是一致的。

 

通过体外实验证明TyrDC是E. faecalis对左旋多巴进行脱羧作用的充分必要条件。菌株E. faecalis MMH594的tyrDC基因经过突变被破坏,就不具有左旋多巴脱羧活性,而它的生长状态与野生型菌没有差异(图1D),并且体外实验发现TyrDC对左旋酪氨酸的作用是左旋多巴的5倍(图1E)。此外,研究了酪氨酸的存在是否会干扰E. faecalis对左旋多巴的脱羧作用,发现在纯化的TyrDC酶和无氧培养的E. faecalis作用下,左旋多巴和酪氨酸的脱羧作用是同时发生的(图1F)。

 

图1 E. faecalis利用依赖PLP的酪氨酸脱羧酶代谢左旋多巴

 

2、Eggerthella lenta菌利用钼依赖的酶对多巴胺脱羟

E. Faecalis没有进一步地代谢多巴胺,本研究用富集培养法分离具有多巴胺脱羟作用的菌,最后发现了一株Eggerthella lenta A2菌具有多巴胺脱羟能力。为了鉴定多巴胺脱羟酶,在E. lenta A2基因组中搜索与4-羟基苯甲酰丙烯酸辅酶A还原酶(4-hydroxybenzoyl-CoA reductase)的同源序列,没有收获。然后对E. lenta A2的RNA进行测序,发现三种共存基因在多巴胺应答中表达上调了2500倍,这些基因预测编码包含双钼嘌呤二核苷酸辅因子的酶,该酶属于二甲基亚砜还原酶家族,猜测该酶是多巴胺脱羟酶(Dadh)(图2A)。

 

验证Dadh是否是钼依赖的,在E. lenta A2培养基中加入钨酸盐,多巴胺的脱羟反应被抑制(图2B)。然后验证Dadh在体外的活性(图2C),脱羟基活性与115-kDa条带相关,经质谱证实为Dadh。

 

然后探究dadh基因在基因组中的存在是否与多巴胺脱羟反应相关。BLASTP表明这个酶只在E. lenta或其相近的放线菌中,因此筛选了26个肠道放线菌,看它们在无氧条件下对多巴胺的脱羟作用,发现尽管26株菌中24株含有dadh基因,只有10株Eggerthella菌具有比较好的脱羟作用,这差异与系统进化树无关(图2D),菌株水平的差异说明对肠道菌只鉴定到种水平是不能很好地对代谢功能进行预测的。为了探究具体的原因,对具有脱羟作用的E. lenta 28B菌和没有脱羟作用的E. lenta DSM2243菌在存在或不存在多巴胺的状态下进行RNA测序,发现在两个菌中dadh对多巴胺应答都出现了上调,表明不是转录水平引起的E. lenta DSM2243菌脱羟作用缺失。通过比较蛋白序列,发现506位上有脱羟作用的是精氨酸,没有脱羟作用的是丝氨酸,只有没有脱羟作用的E. lenta W1BHI6菌是个例外(Arg506, Cys500)。

 

图2 Eggerthella lenta菌利用钼依赖的酶对多巴胺脱羟

 

3、E. faecalis 和 E. lenta代谢人肠道中的左旋多巴

将野生型的E. faecalisE. lenta A2(Arg506)共培养,发现它们能将左旋多巴完全转化为m-酪胺;tyrDC突变的E. faecalis虽然不能转化左旋多巴,但是加入额外的多巴胺后,E. lenta A2仍然能转化多巴胺生成m-酪胺;将野生型的E. faecalisE. lenta DSM2243 (Ser506)共培养只能生成多巴胺(图3A)。

 

探究含氘的左旋多巴在体外粪便悬浮液在E. faecalis 和 E. lenta作用下的代谢情况,发现19个样本中有7个没有检测到左旋多巴的消耗,而其他的样本代谢程度也各异(图3B)。因此考虑tyrDC的丰度是否对代谢能力有影响,通过对tyrDCE. faecalis进行qPCR,发现有代谢的样本tyrDCE. faecalis均高于没有代谢的样本(图3C、D),而E. lentadadh的丰度与左旋多巴代谢没有相关性(图3E、F)。此外发现了tyrDCE. faecalis丰度的强烈相关性,揭示了tyrDC基因在E. faecalis中高度保守。这些数据同时说明E. faecalis菌在人肠道左旋多巴代谢中的重要地位。

 

为了证明E. faecalis在复杂的人肠道中对左旋多巴有脱羧作用,将野生型该菌添加到没有代谢的样本中,左旋多巴发生了消耗;将野生型E. faecalisE. lenta A2添加到没有代谢的样本中,生成了m-酪胺。

 

鉴定dadh基因的SNP,发现含有Arg506的样本可以代谢多巴胺,而含有Ser506的样本和不能代谢多巴胺的E. lenta DSM2243菌一致(图3G)。

 

图3 E. faecalisE. lenta预测左旋多巴在复杂人肠道中的代谢

 

4、(S)-α-Fluoromethyltyrosine (AFMT)抑制肠道微生物对左旋多巴的代谢

卡比多巴(carbidopa)一般作为抑制剂阻断左旋多巴的外围代谢(图4A),本研究发现卡比多巴对TyrDC的阻断作用200倍低于对AADC的阻断作用(图4B、C),且卡比多巴没有影响E. faecalisE. lenta的生长和代谢,这些抑制剂对帕金森患者肠道中的左旋多巴脱羧反应没有起到很好的抑制。2mM的卡比多巴没有改变左旋多巴脱羧的动力学(图4D)。

 

经调研AFMT或许可以作为左旋多巴脱羧的抑制剂(图4A),体外实验AFMF很好地抑制了TyrDC催化的左旋多巴脱羧反应,而对AADC没有很好地抑制(图4E)。AFMF在E. faecalis培养基中也有效(图4C)。最后,AFMT完全抑制帕金森氏症患者和神经健康对照组肠道菌群样本中的左旋多巴脱羧作用(图4G)。

 

为了调研AFMT在体内的作用,将AFMT(25mg/kg)和空白对照联合左旋多巴(10mg/kg)和卡比多巴(30mg/kg)处理E. faecalis MMH594定植的小鼠(图4H),发现AFMT显著增加了小鼠血清中左旋多巴的浓度(图4I)。这些数据表明AFMT可能是研究细菌左旋多巴代谢的一个有前途的工具。

 

图4 E.faecalis对左旋多巴脱羧作用受AFMT抑制而不是卡比多巴

 

 研究结论

1、发现人肠道中对左旋多巴有代谢作用的菌Enterococcus faecalisEggerthella lenta,及其相应基因;

2、发现左旋多巴代谢抑制剂(S)-α-Fluoromethyltyrosine,可抑制肠道微生物对左旋多巴的代谢。

 

亮点

1、利用数据库检索工具,结合转录组测序手段,组合完善的实验验证过程,探究对左旋多巴代谢相关的肠道菌、基因、酶。

2、对肠道菌群进行转录组测序,分析对多巴胺响应的基因,发现有基因上调了2500倍,初步认为它编码多巴胺脱羟酶,后续对其进行实验验证,证明该酶的脱羟作用。

3、对含有dadh基因的不同菌进行转录组测序,分析了dadh基因在不同菌中的转录水平以及SNP,发现转录水平没有影响脱羟作用的活性,而该基因的序列差异(SNP)影响了脱羟能力。

 

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