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2019-07-17浏览量:1504

『锐帮读』利用分离菌胞外代谢组学方法,探究土壤中微生物与代谢物的关系

土壤有机质(SOM)含量和水分长期以来被认为是控制土壤微生物群落结构和碳循环的重要因素。在多种土壤生态系统中,微生物群落多样性和丰富度都与土壤有机质含量呈正相关关系,而土壤的含水量同样也影响微生物的丰度变化。目前干旱地区占地球陆地面积的40%以上,这会导致SOM和微生物多样性减少,从而降低生态系统的生产力。所以土壤中水分、有机质和生物群落结构之间的强耦合作用对干旱土地表层的土壤微生物群落结构尤为重要,而这种微生物群落被称为生物土壤结皮(biocrusts),覆盖了大部分干旱地区,在养分循环中起着至关重要的作用。

 

但是土壤SOM组成与微生物群落结构之间的联系机制尚不清楚,而目前认为土壤微生物所循环的有机质是一种复杂的微生物代谢混合物,可以用土壤代谢组学对其进行详细的表征。这些胞外代谢产物的组成对群落结构有强烈的影响,反过来这些微生物又影响代谢产物组成。所以本文中利用LC/MS技术对土壤水分的动态代谢物组成进行了研究,并采用宏基因组测序技术对优势菌群的单拷贝基因标记物进行了测定,来研究生物结皮样本中土壤微生物与代谢物之间的相互关系。

 

文献ID

题目:Linking soil biology and chemistry in biological soil crust using isolate exometabolomics

译名:利用分离菌胞外代谢组学方法,探究土壤中微生物与代谢物的关系

期刊:Nature Communications   IF:11.878

发表时间:2018

通许作者:Trent R. Northen

发表单位:发表环境基因组学和系统生物学,劳伦斯伯克利国家实验室(美国)

 

材料与方法  

实验设计

 

图1 生物结皮发展的四个阶段

 

图2 生物宏基因组学和代谢组学实验的建立和分析

 

实验组:4个生物结皮演替阶段(A-D,如图1),5个润湿时间,每组5个重复,n=100。

对照组1:无菌超纯水(无土壤样品,D阶段:49.5h,5个润湿时间点,3个重复)。

对照组2:高温灭菌4次的生物结皮(在5个时间点,3个重复)。

 

对4个演替阶段的土壤微生物进行润湿后培养(加入1ml LC-MS等级的无菌水),并在5个时间点取样(总n=100)。对湿润土壤离心,取上清采用液相色谱/质谱法检测代谢物(每组n=5),取沉淀提取DNA进行高通量测序(每组n=1)。除了采用无菌水作空白对照外,同时将土壤高温灭菌后进行单独实验,以去除非生物代谢过程影响(如吸附、光降解等)(图2)。通过斯皮尔曼秩相关分析宏基因组测序得到的物种丰度和代谢物,确定微生物和代谢物之间的关系,并与基于分离菌的胞外代谢组学研究的预期关系进行比较。

  

测序区域及平台

Illumina PE150、LC-MS

 

研究成果

1、基于分离菌胞外代谢组学对原位微生物和代谢物的关系预测

研究四个连续的生物结皮阶段,并基于之前实验得到的优势菌群结果,在整个生物结皮系统中将微生物与代谢物关联起来,并认为一般两者在原位上,随着某一特定微生物在群落中生长和数量的增加,消耗的代谢物会减少,彼此呈现负相关关系,而同时由微生物释放的代谢物会增加,与微生物的生长呈正相关关系(图3)。

 

图3 微生物和代谢物的关系预测

 

2、代谢产物和微生物动力学

利用LC/MS对土壤水分进行检测,共鉴定出了85种代谢物。这些代谢物均在不同润湿时间和演替阶段条件下发生了至少两倍的变化(最小和最大值之间)(图4)。层次聚类分析将代谢物分成3类cluster(图4)。cluster1包括大部分检测到的脂肪酸(月桂酸棕榈酸、十四酸盐、硬脂酸、癸酸盐等占5/7),且在开始3min时最丰富,并随着时间的推移逐步减少。cluster2包含大部分氨基酸和核酸碱基,在早中期最丰富,其中最早被检测到的代谢物包括极性氨基酸(谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、4-草酸脯氨酸、天门冬氨酸和赖氨酸)和碱基酶尿苷、鸟苷和胞苷。cluster3含有最丰富的代谢物种类(如水杨酸、泛酸、烟酸、黄嘌呤、肌酐),主要集中在较晚的时间点和更成熟的生物结皮阶段。

 

图4 生物结皮土壤水分中的代谢物模式

 

3、宏基因组方法推断微生物群落结构

采用核糖体蛋白基因进行物种注释,从宏基因组数据集组装的基因中共定性出17个核糖体蛋白基因(表1),其中rplO (ribosomal protein L15)覆盖范围最广(466个),因此选用该基因作为物质注释和丰度计算。发现在门水平上,早期阶段以蓝细菌门为主(17–28%→1–3% ,3min→49.5 h),到晚期时变为以厚壁菌门为主(4-5%→19-39% ,3min→49.5 h)(图5),其他主要类群包括变形菌门和放线菌变化较小,可能是由于相对丰度在润湿过程中分布会更为均匀。

 

表1 生物结皮宏基因组中识别出的17种核糖体蛋白基因

图5 四个演替阶段中门水平的物种组成

 

将从宏基因组组装的rplO基因与之前研究中分离培养菌体的rplO基因做了序列相似性比较(样本同源)。进一步在分离菌基因组及其相关的本研究中的宏基因组(MAGs)之间计算平均核苷酸均一性ANI(average nucleotide identity),幸运地发现,有四株分离培养菌和本研究的结果具有高度相似性(表2),且在多份样本中,这四种细菌的丰度占总体的30%以上,即为优势物种。

 

表2 分离培养菌与其对应生物结皮中亲缘关系较近的菌种

 

4、微生物和代谢物分别在原位和培养条件下的关系

为了评估微生物-代谢物之间的关系,重点研究Microcoleus sp., Bacillus sp. 1, Bacillus sp. 2和 Blastococcus sp四种菌与其释放或消耗的代谢物关系,预期结果如图3所示。

将本研究检测到的85种代谢物(图4)与之前研究这四种分离菌的代谢结果进行比较,发现有32种共有物质,去除其中9种非生物活性物质,剩下23种与物种进行斯皮尔曼秩相关性分析,找到了48种微生物-代谢物之间的关系,其中69%与预期结果相符(图6)。

 

图6 消耗与释放的代谢产物与微生物的关系

 

利用食物网可视化展现3种优势菌和代谢物的关系:作为代表性的初级生产者(如Microcoleus sp)释放代谢物,异养生物(如 Bacillus sp. 1和2)消耗代谢物(图7),而Blastococcus sp因未呈现连续的动态变化,故不进行展示。

 

随着Microcoleus sp在润湿早期丰度的增加,将代谢物逐渐释放到周围环境中(红色实线),随后 Bacillus sp. 1和2的丰度也得到增加,并导致与此相关的代谢物被消耗而减少,说明这些代谢物与细菌呈负相关(蓝色实线箭头),而被释放的代谢物则与细菌丰度呈正相关(红色实线箭头)。虚线箭头表示被细菌释放(红色)或消耗(蓝色)的代谢物,但没有显示出与原位微生物的预期关系。线条的粗细代表相关的强弱。

 

图7 三种优势菌与代谢产物的生物群落食物网

 

5、土壤微生物-代谢物关系的转录组学结果

对之前一项研究的数据进行进一步分析(该研究评估了湿润和干燥条件下,同一地点采集的生物结皮中M. vaginatus基因的表达)。发现参与氨基酸生物合成的通路(KEGG pathway)在润湿早期均有所增加(图8),这也与在代谢物聚类分析(图4)中cluster2中主要是氨基酸类物质,且在润湿早中期含量较丰富一致。

 

图8 M. vaginatus基因的表达变化

 

研究结论

1、大多数土壤代谢物在不同润湿时间和生物结皮发育阶段中显示出与四种优势细菌的预期关系(正相关或负相关);

2、本研究结果表明,代谢物分析、宏基因组测序和胞外代谢组学可以成功地整合到微生物群落结构与代谢物组成的功能分析上。

 

亮点

1. 首次利用分离菌胞外代谢组学将微生物群落结构与土壤代谢联系起来;

2. 采集成分相对简单的土壤样本,使用的生物结构主要是沙土,与富含粘土和其他表面强吸附矿物质的土壤相比,更利于土壤中代谢物的分析;

3. 本研究采用多组学方法,将土壤化学与土壤微生物群落联系起来,以确定复杂生态系统中微生物的胞外代谢网络,为其他类似研究提供了思路。

 

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【参考文献】

Swenson T L, Karaoz U, Swenson J M, et al. Linking soil biology and chemistry in biological soil crust using isolate exometabolomics[J]. Nature Communications, 2018, 9(1):19.

 

 

 

 

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