导读
克雷伯氏肺炎菌是一种尿路病原体，有证据表明，在频繁发生尿路感染(UTIs)的妇女中，一些相同菌株的复发可能来自膀胱内。本研究针对从一例复发性尿路感染病人不同时间、不同身体部位分离出的克雷伯氏肺炎菌进行全基因组测序分析，旨在追踪身体部位的菌株进程。
文献ID
题目：Whole-Genome Sequencing of Klebsiella pneumoniaeIsolates to Track Strain Progression in a Single Patient With Recurrent Urinary Tract Infection
译名：对一例复发性尿路感染病人中分离的克雷伯氏肺炎菌进行全基因组测序，追踪菌株进程
期刊名：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology
年份：2019 IF： 3.518
通讯作者：David A. Rosen
单位：华盛顿大学医学院
材料与方法
实验设计
不同时间点，从一位26岁女性病人不同身体部位中一共分离出26株克雷伯氏肺炎菌，对其进行全基因组测序。
测序平台
Illumina HiSeq 4000和PacBio SMRT。对26株菌进行HiSeq测序，其中的一株（U1）进行PacBio平台测序。
研究成果
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图1 样本搜集
该病人在初次发生急性膀胱炎（Day0）后又有两次复发（Day11和Day19），患者有泌尿症状的日期用暗红色框表示；最下面绿色条表示抗生素治疗疗程（TMP/SMX , Nitrofurantoin, Ciprofloxacin）；最上方箭头表示单个菌株收集时间, 数字表示收集日期，字母表示收集部位（U，中段尿液；C，导管尿；V，阴道拭子；A，肛周的拭子；F，阴唇系带拭子；R，直肠拭子；P，尿道周拭子）；左侧y轴（红点）表示克雷伯氏肺炎菌（Kp）的每日尿培养滴度，右侧y轴（黑三角）表示尿道周拭子Kp培养滴度（半定量，分成四个层级）。
所有尿液中（U）分离的克雷伯氏肺炎菌都具有相同的抗生素敏感性，即具有氨苄青霉素抗性，而对其他抗菌剂敏感，包括复方新诺明（TMP/SMX）、呋喃咀啶（nitrofurantoin）和环丙沙星（ciprofloxacin）。
对于每次尿道感染，尿道周和尿液的菌培养滴度几乎同时上升。在32至53天之间，尿道周克雷伯氏肺炎菌一直维持在高水平，而没有尿道感染症状。一共分离出26株菌进行全基因组测序。
TOP52 U1菌株同时进行了PacBio和Illumina测序，得到了细菌完成图（5,231,007 bp），只有一个大约19bp的位置模糊不清。此外，还组装出了两个质粒序列P1（171,030 bp）和P2（65,404 bp）。P1与克雷伯氏肺炎菌KpN01质粒（GenBank acc.CP012989.1）序列最接近，与63%的参考序列一致性达到99%。P2与克雷伯氏肺炎菌HZW25质粒（GenBank acc.CP025213.1）序列最接近，与54%的参考序列一致性达到99%。先前史坦顿血清研究所对该菌进行血清分型，得出该菌是K6荚膜血清型。但是本研究中使用TOP52 U1菌的基因组序列包含wzi等位基因150，该基因与KL163，KL27，KL46型相关。KL型和K型荚膜碳水化合物结构的异同还未知。该菌的序列类型为152型。
Illumina测序的26株分离菌都与完整的TOP52 U1组装结果进行了比对，以鉴定基因组的变异。每个基因组的覆盖率都很高，达到了99.8152%到99.9998%，且覆盖深度达到了100.4X到121.8X，没有检测到单核苷酸变异或者小的插入缺失序列（这里指30bp或以下的插入缺失）。从11到13天中分离出的六株菌（P11, P12, P13, R11, U11, V11）的P2质粒检测到大约4,357 bp（59, 982-64, 338 bp处）的序列删除（平均0-8X）。删除的区域包括预测的一个编码绿泥石歧化酶基因，一个编码包含cupin结构域蛋白的基因，一个编码假设蛋白的基因，一个编码SamB家族蛋白的基因以及一个编码耐热核酸酶蛋白的基因。在第13天后收集的所有分离株中均未发现质粒P2的这种缺失。
研究结论
1、在26株克雷伯氏肺炎菌染色体中没有发现SNV和插入缺失序列，如果这种鉴定结果在个体患者中普遍存在，可能需要一种新的方法来进一步明确复发UTI的进程，而不是仅仅依赖于基因或基因组分析。
2、在患者第11至13天的多个部位的分离物中发现了P2质粒的缺失区域，但是随后的UTI相关菌都没有表现出这种缺失，这表明它们并非来自于第一次复发相关的P2缺失菌。
3、虽然克雷伯氏肺炎菌的突变率尚不明确，但之前研究估计其突变率约为每年每个位点10-7个突变，这没有考虑存在于不同宿主环境中的选择压力。随着时间的推移，克雷伯氏肺炎菌通过不同的环境传播到另一个宿主可能会增加突变率。单一的宿主可能不存在相同的选择压力，单凭遗传漂移可能无法在相对较短的时间内获得突变，获得足够的SNVs。
亮点
针对某一位复发性尿路感染病人，取多次复发的不同时间点、不同身体部位分离出的克雷伯氏肺炎菌进行全基因组测序分析，比较菌之间序列变异，追踪身体部位克雷伯氏肺炎菌的菌株进程。
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