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2019-05-17浏览量:1170

『公海赌船网址成果展』喂养方式影响新生羔羊肠道微生物的群落结构和来源

导读

越来越多的证据表明,新生儿肠道微生物群的早期发育对健康至关重要。其中喂养方式是早期微生物定植的重要驱动因素,对调节肠道菌群以及宿主免疫系统、代谢和发育具有关键作用。而目前对不同喂养方式对农场动物早期肠道菌群的影响以及相应的微生物来源知之甚少,尤其是反刍动物。因此该文采用16S rDNA测序并结合qPCR技术,探究喂养方式(母乳喂养或人工喂养)对3日龄羔羊肠道菌群的影响以及不同喂养方式下肠道早期微生物的来源和比例。

文献ID

题目:Feeding modes shape the acquisition and structure of the initial gut microbiota in newborn lambs

译名:喂养方式影响新生羔羊肠道微生物的群落结构和来源

期刊:Environmental Microbiology

发表时间:2019       IF:4.974

第一作者:毕研亮

通讯作者:刁其玉

通讯单位:中国农业科学院饲料研究所

材料与方法

实验设计

选取6只怀有双胞胎且同一天顺产的母羊及相应子代;羔羊出生后,立即将双胞胎中的一只单独关在羊圈,每天人工用奶瓶喂奶两次。双胞胎中另一只与母羊待在一起并以哺乳方式喂养。

样本收集

收集母羊的阴道、口腔、粪便和母乳样本以及腹部、乳头和乳房的皮肤拭子,同时对围栏壁、地板以及羊圈周围空气进行采样。收集3日龄羔羊的空肠内容物。

测序区域及平台

Illumina PE250 V3-V4区

研究成果

1、不同喂养方式下的肠道微生物α多样性

利用测序技术对羔羊粪便(n=12)、母羊相关样本(n=45)和环境样本(n=26)共83个样本进行序列分析,得到2,962,836个clean reads,平均每个样本含有35,697 ± 1,779 reads。两组新生羔羊的粪便菌群的OTU个数和Chao1指数具有显著差异(P<0.05),而Shannon指数和Simpson指数无明显差异(P>0.05)(图1)。在母羊相关样本中,腹部、乳头、乳房和粪便样本的OTU个数和Chao1指数明显高于口腔、阴道和母乳样本,其中母乳的α多样性最低。

图1 α多样性

2、微生物组成和来源

母羊的微生物群落主要由口腔、皮肤、粪便、母乳和阴道菌群等分类群组成(图2A)。在门水平上,口腔和阴道微生物以拟杆菌门和变形菌门为主;粪便、腹部、乳房和乳头皮肤以厚壁菌门和拟杆菌门为主;母乳微生物以变形菌门为主(图3A)。在属水平上,阴道微生物以普氏菌属、拟杆菌属和副球菌属为主;口腔微生物以拟杆菌属、普氏菌属和小链菌属为主;腹部、乳房和乳头皮肤微生物以拟杆菌属和普氏菌属为主;粪便微生物以拟杆菌属和梭菌属XlVa和密螺旋体为主;母乳微生物以假单胞菌属和副球菌属为主(图3B)。

两组之间的环境微生物没有显著差异(图2B)。在门水平上,两组的地板和周围空气以拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门为主;围栏壁微生物以拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和变形菌门为主(图3C);在属水平上,两组的围栏壁微生物以拟杆菌属、棒状杆菌属和普雷沃氏菌属为主;哺乳组中的地板微生物以拟杆菌属、普雷沃氏菌属、副球菌属和假单胞菌属为主,人工喂养组以拟杆菌属、普雷沃氏菌属和考拉杆菌属为主(图3D)。

图2 母羊微生物的PCoA图(a)和环境微生物的PCoA图(b)

图3 物种丰度图

3、不同喂养方式的肠道微生物群落组成

新生羔羊的空肠内容物注释到29个门,其中10个门的相对丰度≥0.1%,主要为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门。两组的优势门相对丰度差异不大(P>0.05),但属水平组成差异较大(表1,图3D)。

两组的共有属为15个(至少一组的属水平的相对丰度≥1%),其中6个属的相对丰度差异显著(表1)。拟杆菌门是丰度最高的门,主要由拟杆菌属组成(表1),在优势拟杆菌属中,仅有副状杆菌存在显著差异(P<0.05)。厚壁菌门(第二丰度门)中的属水平组成在两组之间存在显著差异,其中粪肠杆菌和梭状芽孢杆菌XI在哺乳组中显著富集(P<0.05),产丁酸菌属和梭状芽孢杆菌XIVa在人工喂养组中显著富集(P<0.05)(表1)。与人工喂养组相比,哺乳组中的变形杆菌属(Escherichia/Shigella)的相对丰度显著降低(P<0.05)。

表1 人工喂养组和哺乳组中top15的物种丰度

4、不同喂养方式下肠道微生物β多样性

韦恩图显示了两组之间具有大量共有和特有的OTUs。PCoA结果显示,不同喂养方式的微生物群落存在显著差异(R=0.465, P<0.05)(图4A、4B),同时PCoA和ANOSIM分析也表明肠道菌群在组内的差异略大(图4)。

图4 不同喂养方式的PCoA图

5、总细菌和5个特定细菌的定量研究

采用实时荧光定量PCR方法对总细菌和特定菌群的16S rRNA基因拷贝数进行定量研究。与哺乳组相比,人工喂养组中大肠杆菌、产丁酸菌和梭状芽孢杆菌XIVa的16S rRNA基因拷贝数更多,而梭状芽孢杆菌XI则相反(图5)。总细菌和粪肠球菌的16S rRNA拷贝数在两组之间无显著差异。大肠杆菌、产丁酸菌和梭状芽孢杆菌XI的丰度情况与测序结果相一致。

图5 qPCR验证

6、早期肠道菌群的溯源分析

Bray-Curtis距离分析显示,在OTU水平上,哺乳组中新生羔羊的肠道菌群与母羊的乳头、阴道、口腔和周围空气具有较好的相关性(图6A),表明哺乳组新生羔羊的肠道菌群主要来源于这些生态位。人工喂养组的新生羔羊肠道菌群与母羊的阴道以及周围空气具有较好相关性(图6B),表明人工喂养组新生羔羊的肠道菌群主要来源于这两个生态位。

图6 新生羔羊的肠道菌群与源环境的相关性分析

基于OTU水平的SourceTracker分析显示,哺乳组新生羔羊的肠道微生物主要来源于母羊的乳头(43%)、阴道(7%)、腹部皮肤(6%)、口腔(5%)和周围空气(28%),而人工喂养组的新生羔羊的肠道菌群主要来源于母羊的阴道(46%)、周围空气(31%)和地板(12%)(图7A、7B)。SourceTracker分析显示,对于哺乳组羔羊,母羊的乳头和周围空气可作为其肠道微生物的稳定来源。而对于人工喂养组羔羊,其稳定来源为母羊的阴道和周围空气(图7C)。哺乳组新生羔羊肠道菌群中属水平top15主要来源于母羊的乳头微生物,其中梭状芽孢杆菌XI(来自母羊的阴道)除外。人工喂养组新生羔羊肠道菌群中属水平top15主要来源于母羊的阴道。

图7 溯源分析

研究结论

通过利用16S rDNA测序结合qPCR技术,对不同喂养方式下的3日龄羔羊的肠道菌群及其来源进行研究,发现不同喂养方式影响微生物从母体和环境向新生羔羊的直接传播,从而影响动物的早期肠道菌群结构。

亮点

该研究首次比较了不同喂养方式对新生农场动物早期肠道菌群的影响,并评估母体和环境微生物来源对早期肠道菌群的贡献,为了解早期肠道菌群组成与喂养方式的关系、新生儿肠道菌群的早期建立提供了依据。

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