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2019-05-08浏览量:980

『公海赌船网址成果展』废弃活性污泥混合菌群发酵中微生物的群落动态变化

导读

基于环境生物技术的混合菌群(mixed culture,MC)合成多羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA) 合成工艺逐渐受到关注。而挥发性脂肪酸(VFAs)是废弃活性污泥(WAS)厌氧消化的主要中间代谢物,也是MC合成PHA的适宜底物。

本研究通过进一步优化MC合成PHA的性能,以反应pH值、β-环糊精(β-CD)添加比例和甘油添加比例(C/N比)为调节因子,采用响应曲面设计方法(RSM) 探究奇数碳VFA分子(VFA_odd )酸化工艺定向调控策略,并通过16S测序研究厌氧微生物群落结构的动态演替,以及在VFA_odd酸化过程中的作用,找出与系统功能之间的深层次联系。

文献ID

题目:Oriented acidification of wasted activated sludge (WAS) focused on odd-carbon volatile fatty acid (VFA): Regulation strategy and microbial community dynamics

译文:废弃活性污泥(WAS)定向生产奇数碳挥发性脂肪酸(VFA)研究:调控策略和微生物群落动态

期刊:Water Research  IF:7.051

发表时间:2018.06

通讯作者:陈志强

通讯单位:哈尔滨工业大学环境学院

材料与方法

 实验设计

1、使用两类厌氧反应装置进行WAS的碱性发酵,分别是批次发酵反应装置(图1A)和半连续流完全混合自动发酵反应装置(图1B)。

图1 两种发酵反应装置示意图

2、通过设置反应pH、β-环糊精(β-CD)添加比例和甘油添加比例(C/N比)为调节因子,采用RSM研究定向酸化工艺策略,获得可调控VFA_odd 产量比例和增加酸化率的条件,并在半连续反应器中进一步验证了该调节策略的可靠性和有效性。

通过16S测序研究厌氧微生物群落组成随操作条件变化的动态演替过程,解释在VFA_odd 产酸过程中的作用。

测序区域及平台

16S rRNA基因 V3-V4测序;Illumina平台

研究成果

1、单次产酸试验中典型的酸化过程

在典型单次WAS产酸试验中,VFA、可溶性蛋白和糖类在液相中的时间分布如图2所示(11天,反应pH为8,C/N为20,β-CD为0.1 g/gTSS)。酸化率在第2天达到30.53±2.45%,从第3天到第7天没有明显增加,但在第9天急剧增加到88.72±3.02%,之后相对稳定。

图2 在典型的批次发酵酸化试验中VFA产生和底物消耗

2、基于VFA_odd的RSM定向酸化策略

为了优化PHA产物组成,研究将WAS 酸化液中的奇数碳 VFA分子(VFA_odd)的比例以及对应的酸化率作为调控目标,选取了三个工艺因子:反应 pH(A)、β-CD添加比例(B)以及甘油添加比例(C,以底物 C/N 作为量化指标),使用响应曲面设计方法(response surface methodology,RSM)(表2),在 20 组产酸发酵试验的基础之上,获得了关于两个调控目标的回归方程(如下):

表2 实验范围和水平的影响因素

 

2.1回归模型的ANOVA分析评价

两个回归模型在ANOVA检验F-tests中均获得了极低的概率值:(Pmodel>F)R1= 0.0001,(Pmodel>F)R2= 0.0013,这说明所得模型具有高显著性。

两个模型具有足够高的精度值,R1 R2的精度分别为11.38和9.97,以及相对较低的变异系数(CV1=9.35%;CV2=11.48%),说明两个模型是足够可靠的。

将其中一个变量因子固定,获得两个模型的等高线图如图3所示。基于该模型可以综合调节反应 pH、β-CD添加比例以及发酵底物C/N比,在保证足够酸化率的同时实现 VFA_odd 比例的定向调节。

图3 VFA_odd比例(A-C)和酸化率(D-F)的回归模型等高线图

2.2 三个调节因子的影响

在ANOVA分析的F检验中,当β-CD比例固定为0.2 g/gTSS,C/N比范围15~20,pH值范围8.0~9.5时,VFA_odd 比例超过VFAs总量的60%,可以与丙酸杆菌纯菌发酵效果相媲美(图3B)。

 而在碱性条件下,随着反应pH值的增加,VFA_odd 比例总体呈下降趋势。在RSM分析中,VFA_odd 混合物的主要成分是丙酸(≥90%)。从ANOVA分析得到,甘油比例(9.88)的相对影响权重高于反应pH值(5.99),说明甘油比例是影响VFA_odd生产更重要的因素。

而从图3E可以看出,当β-CD添加量为0.2 g/gTSS,反应pH为7.5 ~ 8.5,C/N为15 ~ 20时,可以得到高酸化率(>90%)。反应pH的影响权重最大,与其他因素相比有最大系数值15.30。但从图3D、E可以看出,当反应pH值为9 ~ 10时,酸化程度明显降低。

2.3 WAS-甘油对VFA_odd 生产的协同作用

为了研究甘油对提高VFA_odd 产量的作用,比较了分别以WAS、甘油(质量分数为10%)以及WAS-甘油混合物的VFA产量(图4A)。结果表明,WAS和甘油中的VFA_odd比例分别为28.5±2.4%和36.2±3.6%,均低于WAS-甘油混合物酸化过程的VFA_odd比例(61.8±2.2%)。表明WAS与甘油的协同作用是提高VFA_odd产量的主要原因。据报道添加富碳底物能促进水解相关酶的释放,进而促进VFAs或相关前体底物的积累,在本研究中,也被证实有相同的促进效果(图4B)。

在进一步评价甘油添加效果时,需要考虑C/N比和添加的碳种类。故在相同C/N下,以淀粉为碳源进行了酸化试验。WAS -甘油混合物的VFA_odd比例明显高于WAS -淀粉混合物(49±3.2%)(图4A),但二者的VFA产率相似(图4B)。这说明,添加甘油的酸化反应对VFA_odd的积累有一定的偏好性,因此,碳的种类在相同C/N的基础上进一步影响了VFA_odd的生产。

图4 以WAS、甘油、WAS-甘油混合物以及WAS-淀粉混合物为底料进行酸化实验得到VFA_odd比例(A)和VFA产量(B)

2.4 试验优化

为使发酵产物在PHA下游生产过程中得到有效利用,所以,除了最大化VFA_odd比例,还要使VFA_odd的比例可以较大幅度地进行调节,同时还要保证足够的酸化率。优化策略由R1R2响应面等高线上的叠加图(通过改变反应pH、C/N,间断改变β-CD投加比例得到)生成(图5)。使VFA_odd比例能够在40%以上,同时酸化率保持在 60%以上,即图中高亮区域为满足条件区域。

图5 VFA_odd比例和酸化率的叠加图

3、半连续发酵生产PHA

从优化的工艺因子范围中,梯度选择了三组工艺因子:工况一(图5A)、工况二(图5B)和工况三(图5C)用于半连续发酵试验。由图6A和图6B可以看出,在这三种情况下,均经过自适应阶段(5~8天)进入平稳的发酵状态,证明了该策略的可行性。

在三种工况下,发酵反应器分别获得了59.51±1.13%、46.57±1.90%以及36.84±0.56%的VFA_odd 比例。ANOVA检验表明,三组工况下的 VFA_odd 比例差异显著(p<0.0001),证明了定向产酸策略能够有效地调节发酵液中 VFA_odd 的比例。而三组工况下的酸化率并未表现出显著性差异。

这两个参数对操作条件变化的灵敏度不同,刚好满足定向产酸所设定的标准,即当调节VFA_odd比例时,保证了足够的酸化程度。在工况1下,最大VFA_odd比例为59.51±1.13%,酸化率为83.23±0.72%,丙酸为VFA混合物的主要成分(图6C)。

图6 半连续发酵试验的VFA_odd比例(A)和酸化率(B)变化,以及不同工况下发酵液中的VFA组分信息

收集三种工况下反应器的酸化液,采用混合菌群培养法生产PHA。由表3可以看出,三种PHA积累试验的最终PHA含量均超过细胞干重的55%。聚合物中HV单体的比例可以从42.3±3.3%变化到72.4±5.2%,与酸化产物中VFA_odd 的比例有高相关性。

以工况1 (HV占72.4±5.2%)为例,以0.81 gCOD PHA/ gCOD S批量PHA生产试验的PHA转化率和0.55 gCOD/gTSS WAS产酸试验的VFA产率为基础,每生产1 kg PHA,需要2.13 kg纯甘油和0.21 kg β-CD。甘油目前是一种过度生产的化学物质,而粗甘油作为生物柴油生产过程中的副产品,可以进一步降低外加碳源的成本。

表3三种工况条件下驯化混合菌群生产PHA

4.1常见优势种4、定向产酸过程中微生物群落动态

在半连续反应器的稳定期取12个样品,其中6个来自工况1,3个来自工况2,3个来自工况3。

基于97%相似度得到的OTUs主要分为7个门,其中变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门由于其降解蛋白质、纤维素和果胶等多种物质的能力,在生物废弃物厌氧酸化反应器中经常被发现。对筛选出的29个常见OTUs进行分类,如图7A所示,主要来自拟杆菌门、放线菌门、α-变形菌门、β-变形菌门、芽孢杆菌纲、梭菌纲和甲烷杆菌纲。

其中,OTU 6(Trichococcus)、OTU 13(Bacteroidetes)和OTU 16(Dechloromonas)在工况1下富集,OTU 6和OTU 4(Methanobrevibacter)在工况2下富集,OTU 6、OTU 11 (Clostridium XIVb)和OTU 8 (Ruminococcaceae)在工况3下富集。

图7 A.常见OTUs的相对丰度及其分类;B.不同工况下Shannon、Simpson指数;C.PCoA分析表示的微生物群落结构比较。

4.2 结构演化

通过对α、β两种微生物群落多样性的比较,揭示了三种工况下微生物群落结构的总体差异。Shannon和Simpson指数显示工况1和工况3下物种丰富度和群落均匀度相似;而工况2中明显较低,如图7B所示。

从PCoA分析中可以看出(图7C),样本按工况明显地分为三组,三组位于PCoA图中不同象限,说明组间差异比组内差异更明显,说明工况条件对微生物群落结构组成有显著影响。

4.3 功能群

在半连续反应器中,利用RDA分析对物种-种、VFA-VFA和VFA-物种三种相关关系进行了评价。

 从图8A可以看出,共有13种常见物种(均在第三象限,颜色为橙色)是与丙酸相关的微生物功能群(用Gprop 表示)。工况从1到3,丙酸的比例从54.40±2.67%下降到33.99±1.96%,同时乙酸、丁酸和戊酸表现出相反的变化趋势。乙酸(蓝色)、丁酸和戊酸(灰色)相关的功能群成员明显少于丙酸。

图8 A.RDA显示常见OTUs与VFA生产之间的关系;B.根据营养级划分功能群;C.常见OTUs和调节因子之间的关系。

对Gprop 中的四个亚组进行划分:生产者、合作者、竞争者和消费者(图8B)。产酸体系中未发现专性丙酸生产物种(如丙酸杆菌属)。由表4可以看出,属于Proteinborus的OTU 21被定义为生产者,因为它被证明能以氨基酸为底物生产丙酸。另外两个生产者分别为OTU 45(Petrimonas)和OTU 78(Clostridiales),被证明能够以乳酸为底物生产丙酸。

OTU 20、42属于乳球菌属,OTU 55属于拟杆菌属,可以定义为合作者,因为它们的最终代谢物如乳酸和琥珀酸,可以被丙酸生产者进一步吸收。

OTU 61(Tissierella)可利用氨基酸作为底物,单独生产乙酸酯,被定义为竞争者,尚没有文献报道其可生产丙酸。该竞争者与丙酸生产者处于相同的营养级(低于合作者),共享相似的资源(乳酸和氨基酸),但表现出同步关系,而不是相反的关系。

Gprop 中OTU 16(Dechloromonas)和OTU 54(Novosphingobium)为消费者,被证明可消费丙酸盐从而减少亚硝酸盐。

表4 功能群中成员的具体信息

用C/N量化Gprop 中细菌对甘油比例的依赖性(如图8C所示),可以解释C/N对VFA_odd生产的主要影响。虽然专性丙酸生产者如丙酸杆菌属Propionibacterium,有一个完整的产丙酸的代谢途径,但是在半连续酸化体系中未检测到该途径,很可能是Gprop 中细菌处在不同营养级(图8),使它们的代谢途径形成一个完整的代谢链:从甘油、氨基酸、丙酸到碳水化合物。

Gprop 中的产酸细菌(如OTU 21)利用氨基酸和糖类,能随甘油利用细菌(如OTU 20)同步变化,由此推测,这种生态协同作用促进了WAS和甘油对VFA_odd 生产的作用。

研究结论

1、本研究以RSM为基础,通过改变反应pH值、添加β-CD和调节甘油的比例,使最终发酵产物在保持较高酸化率的同时,能够提高并有效调节VFA_odd 比例,从而实现以产酸为导向的策略。

2、通过ANOVA分析,发现甘油比例是调节VFA_odd 比例的主要影响因素,碳种类在平衡底料C/N的基础上进一步影响VFA_odd 产量。

3、半连续酸化体系中微生物群落的显著演替变化应是VFA组分变化的内在原因。

4、丙酸生产相关微生物功能群分为生产者、合作者、竞争者和消费者,Gprop 内的生产者和合作者共同促进丙酸在定向产酸过程中的积累。

亮点

本研究通过混合菌群培养法发酵废弃活性污泥,通过RSM分析调节因子研究定向产酸策略,并从微生物群落在发酵过程中的动态演替变化挖掘本质影响因素,为最终合成PHA工艺提供理论基础。

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