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2019-04-10浏览量:1583

『锐帮读』HIV感染肺炎患者肠道菌群与肺部菌群研究

导读

由于猖獗的全身性炎症和无法控制的微生物感染,肺炎在HIV感染患者中很常见,而且往往是致命的。空气中的微生物组成与局部免疫反应相关,肠道微生物也被观察到与外周免疫激活程度相关。本文对患HIV感染肺炎的乌干达人群支气管肺泡灌洗液和粪便进行微生物检测,探究了CD4细胞与呼吸道菌群、肠道菌群的关系,并针对肠道微生物产物对巨噬细胞的影响进行了体外实验。

文献ID

题目:Gut microbiota in HIV-pneumonia patients is related to peripheral CD4 counts, lung microbiota, and in vitro macrophage dysfunction

译文:HIV感染肺炎患者的肠道菌群与外周CD4数量、肺部菌群及体外巨噬细胞功能异常相关

期刊名:Microbiome     

年份:2019  IF:9.133

通讯作者:Susan V.Lynch, Laurence Huang

单位:University of California San Francisco

材料与方法

实验设计

样本:支气管肺泡灌洗样本,n=125,由于呼吸道样本的生物量很少,实验设置阴性对照,且每一步测序实验阴性对照取尽量多体积;粪便样本,n=146。

测序区域及平台

16S rRNA V4区测序、Illumina NextSeq 500

研究成果

1、在HIV感染者中,微生物群的生态位特异性基本保持不变

入组患者的CD4中位值是131 cell ul-1,且几乎都进行了抗生素治疗。对支气管肺泡灌洗样本(BAL)和粪便样本的OTU进行主成分分析(PCoA),发现尽管患者的免疫功能严重受损,不同身体部位的微生物仍表现出明显的差异(图1a)。富集在粪便的微生物主要包括与肠道相关的菌,例如Bacteroides,FaecalibacteriumRuminococcaceae;富集在BAL的微生物主要包括与呼吸道相关的菌,例如Streptococcus,VeillonellaHaemophilus(图1b)。

图1 感染HIV的肺炎患者的粪便和BAL微生物表现出身体特异性

2、下呼吸道微生物组结构明显分层

本研究队列中,下呼吸道微生物组展现出与优势菌科相关的明显组成模式,包括PrevotellaceaeStreptococcaceae,以及Gammaproteobacteria纲下的菌科(图2a)。大部分的下呼吸道微生物组由PrevotellaceaeStreptococcaceae支配,并且伴随着VeillonellaceaeParaprevotellaceae的共定殖(图2b,c)。其他由Gammaproteobacteria支配的样本主要由PasteurellaceaePseudomonadaceae支配,展现出较大的菌群特异性(图2b,c)。为了研究下呼吸道细菌与真菌的关联性,对ITS2序列也进行了扩增,只有26个样本得到了高质量的真菌测序数据,真菌中Candida为优势菌。CD4细胞数量与呼吸道真菌组成有关。

 PrevotellaceaeStreptococcaceae支配的样品相比于Gammaproteobacteria支配的样品展现出更高的香农多样性指数(图2d)。探究了上呼吸道微生物与系统性免疫功能紊乱相关的CD4的联系,发现CD4细胞数量与上呼吸道微生物组成没有关系(图2e)。进一步探究了三种上呼吸道菌群状态与肠道菌群组成是否相关,通过个人成对的呼吸道和粪便微生物Bray-Curtis距离计算,发现三种上呼吸道菌群状态之间呼吸道和粪便微生物距离没有显著差异(图2f)。

图2 在HIV感染肺炎患者中存在三种不同的呼吸道微生物群落,它们与微生物因素有关,而与外周CD4细胞数量或肠道微生物群落组成无关

3、肠道微生物与临床状态及CD4状态相关

粪便微生物组含有高相对丰度的RuminococcaceaeBacteroidaceaeEnterococcaceaeEnterobacteriaceaePrevotellaceae(图3a)。优势菌解释了大部分的菌群差异(图3b)。通过ITS2 rRNA测序调查了粪便真菌的组成。相比于呼吸道样本,粪便样本得到了更多的高质量测序数据(n=90),Candida在粪便样本中也是优势真菌。

为了更好地了解病人的病情,研究了粪便细菌组成和微生物特性的变化与病人治疗和预后的关系。头孢曲松与粪便微生物群组成显著相关,但是只解释了一小部分的变异。这些数据说明,对感染HIV的肺炎患者使用抗菌药物可能不会对已经受到干扰的肠道微生物群产生大的影响。该队列中,出院时的死亡率与粪便微生物群组成有关,而且幸存者有更高的香农多样性指数(图3c)。由于本队列死亡人数有限,影响了对疾病与菌群关系的研究,选择了外周CD4细胞数量这一与疾病严重程度相关的因素作为研究对象。CD4细胞数量与肠道菌群显著相关,且在Enterobacteriaceae支配的样本中数量最低(图3e)。CD4细胞数量多的样本粪便菌群多样性更高(图3f)。

图3 粪便微生物组成与HIV感染肺炎患者的临床和免疫因素及CD4情况有关

4、肠道菌群与呼吸道菌群相关

探究肠道菌群与呼吸道菌群的联系,计算个人(n=120)配对的呼吸道和粪便微生物Bray-Curtis距离(paired distances, P-D),死亡的病人P-D距离比存活的病人低(图3g)。将P-D距离进行分层,P-D距离小的个体,肠道微生物多样性低于P-D距离大的个体(图3f)。

5、低CD4细胞数量与肠道-呼吸道微生物相似性的增加和不同身体部位的菌共享有关

考虑到CD4的降低与更严峻的疾病情况、上皮屏障功能障碍相关,本研究猜测,具有低CD4细胞数量的病人肠道-呼吸道微生物的相似性更高,表明这两个身体部位微生物的转移,而分析结果也验证了这一点(图4a)。拥有高CD4的HIV感染患者富集了传统的肠道菌,包括Faecalibacterium,BacteroidesRuminococcus(图4b),这些菌在配对的支气管肺泡灌洗样本中检测不到。相反地,拥有低CD4的HIV感染患者富集了特别的菌,包括VeillonellaLactobacillalesStreptococcusMegasphaera,后面两种菌在配对的支气管肺泡灌洗样本中能够检测到,说明StreptococcusMegasphaera发生了易位和全身感染。

图4 低CD4的感染患者具有更高的肠-呼吸道微生物相似性,且StreptococcusVeillonella在肠道和呼吸道均富集

6、基于患者CD4细胞数量,肠道微生物产物对巨噬细胞表型有不同的调节作用

外周单核巨噬细胞对于控制下呼吸道微生物感染和肺炎患者炎症是必要的,然而,巨噬细胞功能障碍是晚期HIV感染的一个标志,其特征是肠道内循环单核细胞减少,促炎巨噬细胞增多。本研究猜测,最严重的HIV感染患者肠道微生物相关的产物会促进促炎巨噬细胞效应表型,降低组织修复能力,引起先天免疫功能障碍和感染控制失败。

为了验证猜测,THP-1巨噬细胞系在含有PMA(巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯)的培养基中分化2天后,转移到分别来自于高、低CD4患者的无菌粪水中24小时。经过无菌粪水处理后,使用流式细胞技术评估THP-1细胞的分化(CD14+CD68+)、活化(CD80+CD86+)、促炎症(IL-1β+)和组织修复(CD206+IL-10+)程度。使用低CD4患者无菌粪水处理的THP-1巨噬细胞与使用高CD4患者无菌粪水处理的THP-1巨噬细胞相比,活化程度显著更低(图5a),促炎症显著更高(图5b),组织修复能力更低(图5c)。

图5 经过无菌粪水处理的巨噬细胞

研究结论

1、纳入HIV感染肺炎患者,分析支气管肺泡灌洗及粪便菌群,并测试巨噬细胞在体外的功能;

2、肺部菌群与外周CD4细胞数量无显著关联;

3、肠道菌群的组成显著影响外周CD4细胞数量、肺部菌群组成及患者的死亡率;

4、CD4细胞数量较少的患者的肺部菌群及肠道菌群组成相似,提示菌群易位的发生;

5、CD4细胞数量较少的患者的巨噬细胞经其自身肠道菌群的产物处理后,巨噬细胞活化及IL-10表达降低,IL-1β表达增加。

亮点

1、将HIV感染肺炎患者的支气管肺泡灌洗液和粪便样本进行配对分析,通过Bray-Curtis距离揭示菌群易位;

2、将支气管肺泡灌洗液和粪便菌群与CD4细胞数量进行相关分析,揭示肠道菌群与疾病发展的关系;

3、体外实验,旋涡、离心、无菌过滤后的粪水处理巨噬细胞,研究肠道菌群产物对巨噬细胞的影响。

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