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2019-03-26浏览量:1833

【公海赌船网址新文】新生幼年猪肠道微生物组的时空动态研究揭示了哺乳动物六个肠段微生物群落的早期变化

导读

从出生开始,肠道菌群在哺乳动物的免疫发育和疾病进展中起着重要的作用。了解这种复杂的群落如何随着时间的推移在不同肠道部位的变化,具有重要的生物学意义和医学意义。然而,大多数先前关于肠道菌群的报道都集中在粪便样本上,而忽略了不同肠段的空间微生物动态。使用来自新生幼年猪的六个肠段(十二指肠,空肠,回肠,盲肠,结肠和直肠)的肠道内容物,本文研究在此进行了大规模的基于16S rRNA基因测序的研究,以表征出生后8个猪肠道微生物群的时间点的动态变化。尽管在出生后第1天,6个肠段的幼年猪的微生物群落相似,但它们在后来的时间间隔里各自演化并快速分化。我们也发现,大肠中的微生物与小肠中的微生物相比很不同,并且更稳定。同时,新生幼年猪的肠道微生物在不同的肠段中表现出明显的时空变化。幼年猪肠道微生物数据库可以成为未来早期宿主生长期哺乳动物肠道微生物组发育研究的数据参考。

文献ID

题目:Examination of the temporal and spatial dynamics of the gut microbiome in newborn piglets reveals distinct microbial communities in six intestinal segments

译文:新生幼年猪肠道微生物组的时空动态研究揭示了六个肠段微生物群落的早期变化

发表期刊:Scitific Reports

发表时间:2019年3月5日  IF:4.122

通讯单位:扬州大学&公海赌船网址基因研究院

材料与方法

实验设计

 (扬州大学动物实验伦理委员会的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准了动物研究提案,所有动物实验程序均按照中华人民共和国国务院批准的“实验动物管理条例”进行)

所有梅山幼年猪均来自昆山保护有限公司(中国江苏省苏州市)。在这项研究中,我们选择了5只雌性母猪,它们的年龄,体重和体形相似,并且在同一天分娩。幼年猪接受相同的饮食,并被安置在环境控制的房间里。分娩后,共获得78头新生幼年猪,平均每窝幼年猪15头以上。我们将新生儿的第一天指定为第1天。一旦母猪分娩,每一窝的一头幼年猪立即被选中在一小时内被屠宰。共处死5只相似重量的幼年猪(3只雌性和2只雄性)。屠宰后,同时收集十二指肠,空肠,回肠,盲肠,结肠和直肠中间的消化物样品,并在液氮中快速冷冻。将剩余的幼年猪圈养在环境控制室中的五个围栏中,并在相同的饲养条件下喂养标准猪饲料直至断奶(第35天)。与上述第1天的样本采集程序类似,选择在每次产仔的第7,14,21,28,35,120和180天分娩时使用静脉注射戊巴比妥钠处死每只幼年猪一只幼年猪,使动物最小化痛苦。在每个间隔选择的幼年猪的体重和体形相匹配。在每个时间点,雄性与雌性幼年猪的比例为2:3或3:2,最终性别比为1:1。屠宰后,十二指肠,空肠,回肠,盲肠中间的消化物样本同时从每只动物收集结肠和直肠。收集总共240个样品(在8个发育阶段的每一个中有5个个体;并且对于每个个体,从6个肠段收集消化物)并在液氮中快速冷冻。所有幼年猪在出生后第35天断奶。断奶后,给猪喂食生长日粮。

测序区域及平台

16S rDNA V3-V4区,Illumina PE250测序

研究成果

1、肠道微生物组在不同肠段之间有不同的空间分布

通过对6个肠段 (十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠) 的物种丰度分析,揭示了猪肠道微生物的空间分布(表1)。

预混物提供以下每kg饮食:Fe(硫酸亚铁)80mg,Cu(硫酸铜)15mg,Zn(硫酸锌)80mg,Mn(硫酸锰)5mg,Se(作为亚硒酸钠)0.10mg,I(作为碘化钾)0.10mg,VA 4 480IU,VD3 500IU,VE 20IU,VK3 2.20mg,VB1 1.80mg,VB2 2.20mg,VB6 1.50mg,VB1212μg,叶酸 酸0.30mg,生物素0.05mg,烟酸10mg,泛酸钙8mg。

图1 基于不同肠段之间的加权UniFrac距离的所有230个样品的主坐标分析(PCoA)

图2 基于加权Unifrac距离的六个肠段之间的微生物组差异

图3 基于门丰度(a),属丰度(b)和OTU丰度(c)计算六个肠段的Bray-Curtis差异

图4 基于加权Unifrac距离的小肠和大肠之间的微生物组差异

主坐标分析(PCoA)显示基于肠段的微生物群的空间分布差异(图1)。加权UniFrac距离(ANOSIM R = 0.272,p = 0.001,图2)和Bray-Curtis差异(图3)显示肠道微生物群在六个肠段中差异分布(图1a)。总的来说,六个部分可分为两个不同的组,十二指肠,空肠和回肠组成一个,盲肠,结肠和直肠组成另一个;两组显示出明显的差异(ANOSIM R = 0.395,p = 0.001,图1b和图S3)。这种模式与肠道解剖结构明显一致,即来自小肠的十二指肠和空肠,以及来自大肠的盲肠,结肠和直肠。另外还发现在小肠中,十二指肠和空肠之间存在明显的微生物差异,另一部分是回肠,因为乳酸杆菌在十二指肠和空肠中占主导地位而在回肠中不显着,而存在显着水平的梭杆菌。最后,我们的数据还显示,在本研究过程中,大肠微生物组的组成比小肠微生物组的组成稳定得多(图5)

图5 不同生长阶段不同肠段的肠道微生物群组成

结果排列成六排,对应于六个肠段(即十二指肠,空肠,回肠,盲肠,结肠和直肠,从上到下)和八个对应于八个时间点的柱(即出生后第1天),7,14,21,28,35,120和180,从左到右)。每个饼图表示在给定时间点某个肠段中肠道微生物组的组成。 不同的颜色代表不同的细菌属。 百分比代表个体属的相对丰度。

2、猪肠道微生物群在出生后8个时段的6个肠段中的时间分布

我们接下来分析了肠道微生物群落的时间依赖性动态。加权UniFrac距离(ANOSIM R = 0.18,p = 0.001,图6)和Bray-Curtis差异(图7)显示肠道微生物群在8个不同的出生后间隔时间差异很大。

图6 基于加权Unifrac距离的8个出生后间隔的微生物组差异

图7 基于门丰度(a),属丰度(b)和OTU丰度(c)计算出8个出生后间隔的Bray-Curtis差异

肠道菌群结构在不同肠段中随时间变化很大,特别是在小肠和大肠之间。在小肠中,由Shannon多样性指数表示的肠道微生物组的多样性从出生后第1天到第14天减少,但从出生后第14天增加到第35天和第120天(图8a)。相比之下,在大肠中,肠道微生物组的多样性从第1天到第35天增加,并从第35天增加到第180天(图8b);结果表明,大肠中肠道微生物组多样性在出生后早期增加。在大多数时间点,小肠的Shannon多样性指数高于大肠;然而在后期,大肠肠道微生物Shannon多样性中更大(图8)。

图8 小肠(a)和大肠(b)的香农多样性指数

方框表示四分位数范围(IQR);方框中的线条表示中值。晶须代表从第一和第三四分位数的1.5四分位数范围(IQR)内的最低值和最高值。

结果显示肠道微生物组的巨大变化发生在出生后8个时间间隔(ANOSIM R = 0.18,p = 0.001,图9)。来自出生后第1天的肠道微生物组的样本显示出清晰的聚类(图9a),而出生后期的样本显示出相对较宽的空间分布(图9a),这表明个别肠段中的微生物组成组成不同。第1天后(图9b和9c)。此外,在护理期间(出生后第7天至第35天)和断奶期间(出生后第120天至第180天)。在小肠中,从第1天到哺乳期和断奶期的微生物群落的变化相对较小(图9b)。然而,在大肠中,从第1天到哺乳期和断奶期的微生物群落的变化相对较大(图9c)。总的来说,数据显示个别肠段的微生物群落是高度动态的。

图9 加权UniFrac不同生长阶段的主要坐标分析(PCoA)

(a)根据不同生长阶段的所有230个样本的PCoA;不同颜色的点代表出生后第1,7,14,21,28,35,120和180天的不同样本。(b),(c)小肠中的113个样本的PCoA(b)和117大肠中的样本(c)。颜色代表不同的时间点;1天:蓝色,哺乳期(出生后第7天,第14天,第21天,第28天和第35天):红色,断奶(出生后第120天和第180天):绿色。根据每个间隔的采样点的质心生成的每个“箭头”表示随时间变化的趋势。

3、早期生长阶段幼年猪小肠和大肠中优势肠道微生物随时间的变化

比较出生后第1天和第180天之间的数据显示,在小肠中,出生后第1天的普氏菌和梭杆菌的数量明显低于6个月后的数量。相反,拟杆菌占出生后第1天丰度的9.86%,但该比例在6个月后降至仅4.10%。在大肠中,拟杆菌的相对丰度从27.82%降至4.52%,梭菌从10.5%降至近0%。结果,出生后第1天的拟杆菌和梭状芽孢杆菌的显性状态在6个月后被普氏菌(12.47%)所取代(图10)。

图10 肠道微生物群组成在不同生长阶段的小肠和大肠的属水平

第一行表示小肠的结果,第二行表示大肠的结果。八列代表八个时间点,即从左到右的出生后第1天,第7天,第14天,第21天,第28天,第35天,第120天和第180天。每个饼图表示在一个时间点肠段中肠道微生物组的组成。

4、断奶前和断奶后肠道微生物的变化

结果表明,产后饮食转变对肠道微生物组成有很大影响。此外,当新生幼年猪成熟时,它们从母乳喂养过渡到消耗固体。这些饮食变化可能与个体肠段中肠道微生物组的异常变化有关。在这项研究中,数据显示乳酸杆菌的相对丰度在十二指肠和空肠中最高(图11),并且在母乳喂养期间(7天,14天,21天和28天)其丰度仍然相对较高但是在断奶期(出生后第35天及以后)急剧减少(图S14a)。

图11 230个样品中前20个属的微生物组成的柱状图

横轴表示不同的样本;纵轴表示不同属的相对丰度。不同的颜色代表不同的细菌属。

在该研究中,拟杆菌是出生后第1天和第7天肠段中最丰富的(图11)。结果显示,Veillonella的相对丰度曲线与十二指肠和盲肠中的乳杆菌相反(图12)。结果表明,Veillonella也与上述幼年猪的饮食转变有关。除了在两个营养摄入量变化点发生的微生物变化之外,我们的数据还显示一些微生物在其他时间点显示出显着的丰度变化。在断奶前,幼年猪通过母乳喂养获得营养。

图12 两个属的相对丰度曲线响应饮食变化

a十二指肠中Veillonella(蓝色)和乳酸杆菌(红色)的动态。 b盲肠中Veillonella(蓝色)和乳酸杆菌(红色)的动态。

研究结论

使用新生幼年猪,我们在本文中显示六个肠段(十二指肠,空肠,回肠,盲肠,结肠和直肠)在微生物组成中表现出巨大差异,并且这些微生物组合物在八个不同的出生后间隔期间是高度动态的。此外,在幼年猪发育期间,含有潜在致病物种的某些属的相对丰度发生了改变。我们的研究结果表明,肠道微生物群很复杂,可能会受到其他因素的影响,如饮食、免疫等。

亮点

1、以新生幼年猪为研究对象,揭示了哺乳动物幼年早期肠道微生物在六个肠段的定植和随时间的变化。

2、发现在小肠和大肠中,肠道微生物在早期时空变化中存在明显的差异。

3、发现一些肠道微生物在断奶期变化巨大,这些菌群可能与饮食关系密切;也发现一些肠道微生物在饮食未发生改变时期变化很大,这些菌可能与自身免疫形成存在关系。

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