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2019-03-22浏览量:1431

口服益生菌通过肠道微生物 - 炎症轴改善小鼠慢性轻度应激引起的行为缺陷

导读

抑郁症是一种普遍的存在的使人衰弱的神经精神疾病,是自杀早期死亡的主要原因,并造成巨大的社会经济影响;然而,其发病机制尚未得到充分阐明。抑郁症治疗不足和治疗效果差(仅有30%的MDD病例在一线抗抑郁治疗后缓解)是世界性问题。寻找有效的治疗方案尤为重要。近期的动物和人类研究表明,包括益生菌、抗生素、膳食补充剂或粪便菌群移植在内的肠道微生物菌群干预可能是治疗神经精神疾病的有效方法。益生菌在减轻心理障碍方面的有益作用与其保护肠屏障,改善粘膜和全身免疫力,使紊乱的下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴正常化,恢复神经递质和脑源性神经营养因子水平的作用密切相关;最常见的益生菌是乳杆菌属或双歧杆菌属。然而,这些益生菌的影响机制仍不清楚。本研究中,我们探索了一种多株益生菌(Lactobacillus helveticus R0052, Lactobacillus plantarum R1012,Bifidobacterium longum R0175)联合治疗模式在慢性轻度压力(CMS)小鼠抑郁症模型中的抗抑郁疗效,并探索其可能的作用机制。

文献ID

题目:Oral Probiotics Ameliorate the Behavioral Deficits Induced by Chronic Mild Stress in Mice via the Gut Microbiota-Inflammation Axis

译名:口服益生菌通过肠道微生物 - 炎症轴改善小鼠慢性轻度应激引起的行为缺陷

期刊:frontier in Behavioral Neuroscience

发表时间:2018年  IF:3.138

第一作者:李楠楠

通讯作者:李晓白

通讯作者单位:中国医科大学附属第一医院

材料与方法

 实验设计

研究群体:6-8周的C57BL/6雄性小鼠48只随机分为六组,每组8只。

CMS+NS组:CMS方案+生理盐水

CMS+F组:CMS方案+氟西汀

CMS+P组:CMS方案+益生菌 

CON+NS组:生理盐水

CON+F组:氟西汀 

CON+P组:益生菌

 处理:

CMS方案(慢性轻度压力):笼子45°(24小时)倾斜,食物和水缺乏(24小时),夹尾部(60秒,距离尾部1厘米),昼夜颠倒(24小时),频闪照明(在黑暗中闪光400次/分,10小时),约束在50毫升塑料注射器管中(2小时),和潮湿的草垫(200毫升的水洒在草垫上,8小时),共4周。连续两天没有应用相同的压力源。

CON方案(无慢性轻度压力):12小时光照/黑暗循环,标准条件(21±1℃和55±2%湿度),充足的食物和水。

饲喂:

NS(生理盐水)200μl/d灌胃;

F(氟西汀)18mg / kg的标准灌胃;

P(益生菌Lactobacillus helveticus R0052, Lactobacillus plantarum R1012, andBifidobacterium longum R0175)混合物2*109CFU/d灌胃;

4周实验结束以后分别对小鼠进行SPT(蔗糖偏好测试)、EPM(高架十字迷宫)和FST(强迫游泳测试)。

图1 实验设计方案

测序区域及平台

16S V3+V4区测序,Illumina Hiseq平台

研究成果

1、益生菌改善了CMS诱导的焦虑和抑郁行为

在基线阶段,蔗糖偏好指数在六组之间没有显著差异[ F(2,42)= 0.234,P = 0.792] ,CMS方案有效地诱导了SPT,EPM和FST中的焦虑和抑郁样行为。由CMS方案诱导的所有行为改变通过氟西汀给药逆转,益生菌治疗部分逆转了EPM中的焦虑行为和FST中的绝望行为,然而,在SPT中未发现蔗糖偏好性的显著增加(图2)。

图2 小鼠行为的评估结果

(A)基线阶段六组的蔗糖偏好没有差异(B)SPT测试显示总液体消耗量差异不显著(C) CMS+NS组4周后蔗糖偏好显著降低,氟西汀逆转这种CMS刺激,而益生菌效果不太好。(D) EPM测试结果显示,CMS +NS组在开放臂中花费的时间显著减少,氟西汀和益生菌逆转了这种CMS刺激。(E)FST结果显示CMS+NS组的不动时间显著增加;CMS引起的不动时间通过氟西汀或益生菌作用减少了。CON三组比较显示,与益生菌作用相比,氟西汀作用的不动时间显著减少。与CMS + NS组相比, * P <0.05,** P <0.01,*** P <0.001,#P与CON + P组相比<0.05。

2、组间群落结构多样性分析

基于加权和非加权的Anosim的β-多样性分析,表明六组之间细菌群落结构差异显著(R = 0.605,P = 0.001和R = 0.294,P = 0.001)(图3A,B)。未加权PCoA显示出CMS + NS,CMS + F和CMS + P组明显聚类(图3C))。CMS处理的样品中的微生物群与CON组的微生物群显著不同,表明CMS处理可能破坏了现有的肠道菌群。α-多样性分析显示CMS处理的样本中的多样性和物种均匀度更高,但CMS + NS组,CMS + F组和CMS + P组之间没有显著差异(图3D,E)。

所有样本的肠道微生物群主要属于两个门,厚壁菌门和拟杆菌门(86.7±9.1%)。非参数Kruskal-Wallis检验应用于属水平的微生物群数据,确定CMS刺激使乳杆菌属丰度显著降低。与CON + NS组(35.1±18.1%,P <0.001)和CON + P组(26.6±13.0%,P = 0.003)相比,CMS + NS组的乳杆菌比例显著降低(6.6±2.8%)。CMS + P组(18.6±10.5%)与CMS + NS组(P = 0.028)相比具有更高的乳杆菌丰度; 然而,接受氟西汀[CON + F组(19.5±14.1%,P = 0.05)和CMS + F组(16.0±13.7%,P = 0.083)]没有显著变化(图3F,G)。

图3 肠道菌群的变化

(A)未加权的Anosim分析表示各组之间存在显著差异。(B)加权的Anosim分析表示各组之间存在显著差异。(C)未加权PCoA分析显示CMS组和CON组之间微生物群落组成的明显差异。(D)α多样性指数Chao1揭示了物种丰富度有差异; CMS刺激样本呈现出更高的多样性。(E)α-多样性指数,Simpson揭示了物种均匀度的差异; CMS刺激样本呈现出更高的物种均匀度。(F)相对于CMS + NS组,其余组乳杆菌属的相对丰度,* P <0.05,** P <0.01,*** P <0.001。(G)所有样本中丰富前20的属。

3、海马体炎症细胞因子水平的差异显著

在海马体中检测到促炎细胞因子IFN-γ,IL-6和TNF-α以及抗炎细胞因子IL-10以评估炎症状态。双向方差分析结果显示,应激作用对海马体中IL-6和IL-10水平影响不显著。IFN-γ表达显示应激作用和给药对其有显著影响。分析发现CMS+NS组的IFN-γ表达显著增加(CON + NS组与CMS + NS组,P<0.001),CMS+P组与CMS+F组可降低IFN-γ水平。应激水平[ F(1,42)= 13.394,P = 0.001]和给药[ F(2,42)= 8.343,P = 0.001]均对海马体中TNF-α表达有显著影响,但无统计学差异。此外,与CON + NS组小鼠相比,CMS + NS组小鼠TNF-α表达显著增加(P <0.001),CMS组中氟西汀或益生菌补充与较低的TNF-α水平相关(CMS + F vs .CMS + NS,P <0.001且CMS + P vs .CMS + NS,P = 0.004)(图4)。

图4 海马体中的细胞因子浓度

(A)6组间IL-6水平无显著差异。(B)CMS刺激显著增加海马中的IFN-γ表达,这可以通过补充益生菌或氟西汀来逆转。(C)CMS刺激显著增加海马中TNF-α水平,可通过补充益生菌或氟西汀逆转。(D)6组间IL-10水平无显著差异。数据表示为平均值±SEM;每组n = 8;* P <0.05,** P <0.01,*** P. 与CMS + NS组相比<0.001。

双向方差分析结果显示IDO1表达差异显著,CON和CMS组间差异显著,CON+NS组与CMS+NS组差异极显著。补充益生菌或氟西汀能够显著减少海马体中的IDO1蛋白水平(CMS+NS组与CMS+F组, P = 0.035和CMS+P组与CMS+NS组, P = 0.026)(图5)。

图5 IDO1蛋白水平

上图:IDO1的Western印迹。下图:标准化为β-肌动蛋白的IDO1蛋白强度的ImageJ分析;每组n = 4;* P <0.05; ** P <0.01。

研究结论

1、我们的研究结果表明,CMS刺激使肠道微生物组结构和群落、促炎细胞因子和IDO1蛋白水平发生了显著变化。

2、益生菌可以通过降低海马体中促炎细胞因子(IFN-g和TNF-a)水平,同时直接或炎症介导的抑制IDO1活性,调节啮齿类动物与CMS刺激的行为。

亮点

1、我们发现益生菌混合菌株可以减轻CMS诱导的小鼠焦虑和抑郁样行为及神经炎症和肠道微生物群的变化。

2、我们的研究结果表明肠道微生物群紊乱与抑郁症的病理生理学密切相关。

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