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2018-10-28浏览量:10637

拿小鼠做菌群研究,要小心这些“雷区”

 

实验

小鼠因其繁殖力强、体型小、易于饲养管理等特点,一直被广泛应用于各类研究。在菌群研究中,已有很多报道表明调控肠道菌群是改善人体健康状态的一种有效手段,但是在人体中对疾病和菌群之间的动态相关性研究仍然存在局限,那么小鼠模型在研究宿主-菌群之间的相互关系中就成为方便且极其有效的工具。

案例

例如我们最近与合作单位在《Microbiome》上发表的关于白塞病的文章,就是将患者和健康者的粪便菌群移植给眼炎小鼠模型,结果移植了患者粪菌的受体小鼠的眼炎症状明显加重,之后又通过对小鼠结肠内容物进行微生物组测序分析,发现患者粪菌移植组的小鼠中富集的菌群与患者微生物组测序结果一致。

 既然小鼠模型这么“棒棒”,那在肠道菌群研究中,我们应该避开哪些“雷区”,又该如何合理有效的利用小鼠模型,来帮助老师们深入研究,为文章加分呢?下面就来介绍一下~

 实验小鼠的分类

根据ICLAS按照病原体的病原性强弱所划分的微生物分类标准,可以将病原体分为5类,即人畜共患病微生物(Ⅰ类)、动物的烈性传染病微生物(Ⅱ类)、动物的弱致病性微生物(Ⅲ类)、能引起动物隐性感染和潜伏感染的微生物(Ⅳ类)以及非致病性微生物(Ⅴ类)。

 下图中是根据实验动物中含有的微生物种类将其划分为四个等级,目前实行的国家标准(GB 14922.2-2011)里,实验小鼠已经不采用普通级了,但是大型动物仍然适用。

简单来说,无菌小鼠是不含有一切微生物和寄生虫的小鼠,悉生小鼠是含有菌都已确知的小鼠。无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)小鼠是不含有Ⅰ-Ⅳ类微生物的小鼠。另外清洁级是不含有Ⅰ-Ⅲ类微生物,普通级是不含有Ⅰ-Ⅱ类微生物。

根据不同的实验目的,我们会设计方案,以饮食调控、用药等方式对小鼠进行干预,并观察其生理状态、代谢指标、菌群指标等因素的变化。因此,在实验开始之前,需要尽量避免和降低实验的各种干扰因素。

对于菌群研究而言,这就需要确保各组小鼠的初始菌群保持一致,将本底菌群差异降到最低。在普遍的实验流程里,这一条通常通过采用无菌小鼠或者用抗生素处理过的低菌/短期无菌的SPF级小鼠来实现。另外,为了避免实验过程中环境微生物的污染,要将小鼠饲养在隔离系统(无菌小鼠)或者屏障系统(SPF级小鼠)中。

影响实验小鼠肠道菌群的因素

以往研究发现,会对小鼠肠道菌群产生影响的因素主要分为小鼠自身因素和环境因素。以下分别作出详细的阐述。

小鼠自身因素

 

 ♥品系 ♥

 

Hildebrand等人比较了不同基因型小鼠的菌群差异,发现不同品系小鼠之间的基因型越相似(遗传距离越近),其肠道菌群的组成就越相似。所以在进行菌群研究中,要选择近交系即基因型完全一样的小鼠品系。而在同一品系的小鼠中,亲缘关系远近对菌群组成也有影响。例如,同母小鼠的肠道菌群组成要比其他小鼠更相似,所以在设置实验分组时,通常采用同胞小鼠(littermates)做对照。

 

年龄 ♥

 和人类一样,小鼠在刚刚出生时的肠道微生物极少,其成分主要受母亲菌群的影响。随着小鼠的成长,其肠道微生物的组成也慢慢发生变化,直至形成平衡的稳态。在这个过程中,可根据周龄和生活方式将小鼠分为出生期、断奶期、成年期(如下图)。

出生期时小鼠的肠道微生物主要来自母体和环境,在这个时期,由于小鼠的免疫系统并不成熟,所以其整体健康状态和菌群组成不稳定,易受外界环境的影响。

在断奶期,由于小鼠饮食发生了从母乳到固体食物的过渡,肠道微生物的变化突然加速,向趋于成年动物肠道微生态系统的方向趋近。但是,因为其免疫系统仍在建立和发展的过程中,所以菌群结构仍然容易受到外界人为或自然的影响。成年期小鼠的免疫系统已经成熟,其肠道微生态系统也已经相对稳定,在外界环境轻微改变的情况下,可以进行自我调节和修复。

所以,除了特意考察小鼠幼年菌群变化的研究之外,在其他实验过程中,尽量选择成年期的小鼠,这样在实验过程中可以尽量减少由人为操作和环境误差带来的影响。

 性别 ♥

 

性别对小鼠肠道菌群影响的相关研究较少。之前Hildebrand等人比较了B6小鼠不同性别对肠道菌群的影响,发现没有显著差异。但是在Markle等人对NOD(no obesity diabetes,非肥胖型糖尿病)小鼠的一项研究中,发现断奶期小鼠不同性别的菌群没有差异,但是从青春期开始,不同性别个体的菌群组成出现了明显差异,这一差异在成年期变得更加明显,推测这一现象是由于微生物在雄性小鼠中的定植提高了血清睾酮水平,因其对Ⅰ型糖尿病有治疗作用而产生肠道菌群差异。而将成年雄性小鼠的肠道菌群移植给未成年的雌性小鼠后,发现增加了雌性小鼠的睾酮水平,减少了胰岛炎症和自身抗体的产生,极大地减少了Ⅰ型糖尿病的发病率。这说明在一些性激素调节的自身免疫疾病中,由于不同性别的小鼠性激素水平不同,发病情况不同,肠道菌群也会有差异,但是因果关系尚不明确。所以在此类型疾病与菌群相关研究中,尤其要注意小鼠性别的影响。另外,雌雄小鼠性激素水平的差异会一定程度引起免疫应答差异。在一些需要性激素调节的炎症反应和免疫基因表达的通路中,不同的性激素会造成T细胞介导的炎症反应不同,以及为了对抗细菌侵染产生不同的细胞因子,从而造成肠道菌群的差异。所以在实验设计中,如果同时包含雌雄两种小鼠,一定要对性别进行严格记录,控制可能因性别造成的菌群差异。 

♣ ♣环境因子影响

 

  饮食 ♥

 

出生前后,鼠宝宝的菌群定植会受到母亲饮食的影响,而且哺乳期母体饮食对幼鼠菌群的影响比孕期饮食的影响更大。

在断奶期,由于小鼠开始食用饲料,此时小鼠的肠道微生物组成主要受饲料成分的影响。需要注意的是,小鼠的饲料要经过高压灭菌或者直接购买无菌的小鼠饲料,但由于购买的无菌饲料多采用射线灭菌,不同的灭菌方式对饲料的灭菌程度不同,所以在实验中,要尽量保持整个过程中饲料的一致性,最好采用同一批次。有研究发现,更换饲料本身(而非给药)即可引起易感小鼠的结肠炎发作,进一步研究表明,是饲料的更换引起了小鼠肠道微生物的快速改变,激活易感小鼠中特定的T细胞群体,从而引起结肠炎,而这两种饲料仅在营养元素比例上有很小的差异。

 

 饲养环境 

 

 垫料:作为饲养小鼠过程中必不可少的一环,不仅可以吸收尿液和粪便,保持笼舍卫生,而且能够满足小鼠的生活习性,如搜寻、挖掘和筑巢。在实验中,同样要注意垫料也需进行灭菌处理。

另外不同材质的垫料的性能有所区别,例如刨花质地松软、便宜易得,但是换料次数较多,容易造成污染;玉米芯毒性小、保温性高,但是易被小鼠吃掉等。所以在选择垫料过程中要综合考虑,将对小鼠的影响降到最小。有研究曾比较了不同垫料(纸棉和玉米芯)对小鼠肠道微生物组成的影响,没有发现明显差异。但是,仍要注意垫料更换过程中的微生物污染是影响小鼠菌群的一个非常重要的因素。

同笼效应成年小鼠具有食粪习性。如果笼中小鼠粪便和尿液不及时清理,会对垫料及饮用水等造成污染。小鼠在食用自己或者其他小鼠的粪便,或啃食垫料时,与其它小鼠进行了肠道微生物的交换,导致同笼小鼠的肠道微生物差异随着共同生活时间的延长而逐渐缩小。同时,成年雄性小鼠同笼时会发生争斗;同笼个体数量过多亦会在种群内形成等级关系,这些都会对小鼠个体造成不同程度的压力,导致其生活习惯乃至菌群的改变。

所以,在条件允许的情况下,建议尽量将小鼠分笼单独饲养,或采用代谢笼饲养。代谢笼能够在饲养小鼠过程中,将小鼠的粪便和尿液分开单独收集,不会对垫料、食物、饮水等物质造成污染,避免同笼效应。

参考文献:

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