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2018-09-18浏览量:1242

早产儿粪便的微生物组和代谢组是个性化的,不受坏死性小肠结肠炎和晚发性脓毒症的驱动

导读

婴儿肠道微生物组建立和发展对其长期健康具有重要影响。早产儿可能面临着因过早暴露在微生物环境中而引起的健康问题,包括败血症和坏死性小肠结肠炎(NEC)。然而,关于肠道微生物组对早产儿健康的作用研究较少,不同于健康足月婴儿,早产儿的微生物定植发生在新生儿重症监护病房,并且经常受到抗生素干扰。本实验采用16S rRNA基因测序和非靶向气相色谱 - 质谱法研究细菌菌群和代谢组特征,通过测量来自32名早产儿的77份粪便样本的细菌组成和代谢组学,以研究其微生物组和代谢组在健康和疾病方面的差异。研究发现,早产婴儿肠道微生物组是富含微生物的,并且响应抗生素的使用,也发现早产婴儿微生物组和代谢组都是个性化的。这些结果有助于增加早产婴儿微生物组的知识,从而服务于早产婴儿微生物组的健康。由于早期暴露于细菌环境和频繁使用抗生素,早产儿菌群定植异常。为了更好地理解早产儿肠道微生物群的建立,在生命的前6周,从32名极低出生体重的早产儿中,收集粪便样品。婴儿健康结果包括健康、迟发性败血症和坏死性小肠结肠炎。

文献ID

题目:The Microbiome and Metabolome of Preterm Infant Stool Are Personalized and Not Driven by Health Outcomes, Including Necrotizing Enterocolitis and Late-Onset Sepsis

译名:早产儿粪便的微生物组和代谢组是个性化的,不受坏死性小肠结肠炎和晚发性脓毒症的驱动

期刊:MSPHERE

年份:2018.6            IF= 3.575

通讯作者:Katrine Whiteson

通讯单位:加州大学欧文分校

 材料与方法

实验设计

  • 患者情况

 2011年至2014年,在加利福尼亚州奥兰治县儿童医院的新生儿重症监护病房(NICU),从32名极低出生体重婴儿中收集了77份粪便样本(表1;图1)。10名婴儿阴道分娩,其余22名通过剖腹产分娩。出生体重为620g-1,570g。所有婴儿都以母乳或母乳和配方奶的组合喂养。在生命的第7天和第75天之间收集粪便样品,采样时间和粪便样本数量各不相同。期间3名婴儿发生坏死性小肠结肠炎,8名婴儿发生迟发性败血症,21名婴儿保持健康。 24名婴儿在采样期间的某个时间点接受了抗生素治疗,最常见的是氨苄西林和庆大霉素。

表1:所有婴儿的临床和取样信息

图1研究设计示意图

 收集NICU极低出生体重婴儿的前75天粪便样品,测定了细菌组成和代谢组学特征。


测序区域及平台

16S rDNA

测序引物:

5'-TCCTACGGG AGGCAGCAGT-3 

5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3

 研究成果

一、微生物群落特征

通过16S rRNA基因的定量PCR(qPCR)测量每个粪便样品的细菌组成,从单位粪便中提取DNA的量记为细菌载荷。在所有婴儿中,细菌丰度变化超过4个数量级,并且在NEC或迟发性败血症的婴儿中细菌丰度更低(P <0.001)(图2)。细菌丰度的高度变化可能是由于使用抗生素导致的。细菌群落主要由肠杆菌科、肠球菌属、葡萄球菌属和拟杆菌属组成(图2)。大多数样品由一至三个属细菌占主导地位,只有三个婴儿(两个喂养的母乳,一个喂养的母乳和配方奶粉)被双歧杆菌以相对丰度1%定殖,新出现的证据表明,双歧杆菌是婴儿微生物组的关键成员。然而,本研究所使用的引物能检测到核糖体数据库中30%的双歧杆菌物种(5,146个中的1,741个),其中包括38个婴儿双歧杆菌亚种,能检测到数据库中所有细菌物种的68%(3,196,041个中的2,177,663个)。与保持健康的婴儿相比,对于生病的婴儿(NEC或迟发性败血症),没有一致的细菌OTU或群落组成。

图2 早产儿肠道的细菌组成和细菌载荷

堆积条形图显示,所有婴儿样本中细菌属的相对丰度。科(f)包括肠杆菌科,因为没有属级别的分辨率。下方显示每个样品的对数标度相对细菌载荷

纵向采样显示,在不同采样时间,细菌组成发生显着变化(图3)。应用置换多变量方差分析(PERMANOVA)来确定哪些已知临床因素解释了细菌群落组成的变化,其中个体解释了样本中方差的48%(P <0.001),递送模式解释了较小比例的方差(12%方差,P≤0.05),但其他因素(包括婴儿健康,NICU中时间或喂养模式)不能解释细菌组成的显著变化。只有阴道分娩出生的婴儿(10个婴儿中的4个)被拟杆菌定植,而剖腹产的22个婴儿中没有一个被定植。该研究中有8名婴儿是双胞胎。双胞胎1(婴儿12和13)具有相似的微生物组成,而其他三个双胞胎没有。


图3 随时间变化,基于婴儿样品细菌群落间加权UniFrac距离计算的PCoA分析第一主成分的变化趋势

每个点代表一个粪便样本,并由婴儿序号标记颜色。线连接每个婴儿的样本以显示随时间的变化。仅适用于具有三个或更多纵向样品的婴儿。PC1,PCoA的第一轴。

正如预期的早产儿细菌群落的多样性很低。通过香农指数测量的α多样性总体随着年龄增加而增加,但趋势不显着(图4A)。 测试了其他临床因素,包括健康结果、喂养方式、抗生素使用和分娩方式对α多样性的影响(图4B至E),除了记录的抗生素使用外,其他因素与α多样性的差异无关,其中Shannon多样性在没有接受抗生素记录的婴儿中意外地低。应该指出的是,虽然有六名婴儿没有抗生素使用记录,但由于医院转移,记录可能不完整。

图4 通过香农指数衡量α多样性的细菌组成

(A)婴儿不同时间段的α多样性。(B)每个婴儿的平均α多样性的箱形图,由健康结果划分分组。(C)仅喂食母乳或婴儿配方奶和母乳的婴儿α多样性。(D)抗生素使用对应的α多样性。(E)递送模式对应α多样性。

二、代谢组学

通过气相色谱- 质谱法测量分析婴儿粪便样品的小分子初级代谢物。检测到超过400个小分子代谢物,其中224个代谢物是已知化合物。主要分为以下几类:氨基酸代谢产物、胆汁酸、中心代谢产物,脂肪酸、发酵代谢产物,脂质代谢产物,核苷酸代谢产物,有机酸,甾醇,糖,糖酸,糖醇和维生素代谢(图5)。没有发现代谢物或代谢物类别与坏死性小肠结肠炎或迟发性败血症相关。观察到每个婴儿的代谢物特征随时间变化,并且变化趋势类似于微生物组的变化趋势(图6)。 PERMANOVA确定哪些因素解释了代谢物谱的最大变化,表明个体差异解释了43%(P <0.001)的变异。

图5  早产儿粪便样品的代谢物谱

颜色表示高于或低于所有婴儿样品中每种代谢物丰度均值的强度。红色表示低于中值的标准偏差,蓝色表示高于每种代谢物的中值的标准偏差。 横轴上的样本按婴儿分组并依时间纵向排序。纵轴每类中的代谢物列于补充材料中。

为了确定哪些代谢物可用于追踪婴儿肠道中的细菌代谢,研究检查了与不同物种具有一致丰度的代谢物。相对于糖,中心代谢物和氨基酸来说,脂肪酸,甾醇,有机酸和胆汁酸丰度和物种丰度变化更加一致。婴儿23在出生后第16天出现坏死性小肠结肠炎,在疾病发作前2天具有低丰度的氨基酸代谢物(图5)。 然而,一些健康对照婴儿也具有类似的低丰度的氨基酸代谢物。因此,每个婴儿代谢组由个体带来的信号变化比其他任何临床因素带来的变化更明显。


图6 随时间变化,基于婴儿样品代谢物谱随计算的PCoA分析第一主成分的变化趋势

计算样本之间的曼哈顿距离并通过PCoA分析可视化。每个点代表一个粪便样本,并由婴儿序号标记颜色。线连接每个婴儿的样本以显示随时间的变化。仅适用于具有三个或更多纵向样品的婴儿。PC1,PCoA的第一轴。

三、细菌组成与代谢物谱相关性

在粪便样品中检测到的代谢物部分来源于肠道中细菌的代谢。为了确定具有相似细菌组成的粪便样品,其代谢物特征是否也相似。本研究采用Mantel测试样本细菌组成之间的距离与样本代谢物谱之间的距离的Pearson相关系数。由于细菌组成和代谢组特征是个性化的,因此使用来自单个婴儿的多个样本会使结果产生偏差。因此,随机选择来自每个婴儿的一个样品100次以去除个体的效果,并且对每个子集应用Mantel测试。结果表明细菌组成和代谢物谱之间存在微弱但显着的相关性。此外,在个体婴儿中,细菌组成的变化伴随着代谢组的变化。婴儿17,23和31随着时间的推移在细菌组成和代谢组特征都发生了显着的变化,而婴儿10和37在它们的细菌组成和它们的代谢组都保持稳定。

 为了研究这种总体相关性的驱动因素,本研究计算了细菌丰度和代谢物丰度之间的相关性(图7A)。金黄色葡萄球菌与代谢物呈现最高的正相关性,包与几类糖代谢物,有机酸和中心代谢产物。脂肪酸,脂质代谢产物和氨基酸与肠道通常高丰度的定殖菌-肠杆菌、拟杆菌呈正相关,与常见的低丰度定殖菌-葡萄球菌、肠球菌呈负相关。 此外,具体地研究了与细菌丰度相关的个体代谢物(图7B),发现拟杆菌与琥珀酸正相关(r≥0.85)。 细菌丰度和代谢物丰度之间存在许多其他弱相关性(r≥0.5),但样本量不足以将噪声信号区分开来。

 研究结论

由于经常的抗生素给药,早产儿粪便样本缺乏有益的双歧杆菌属,其优势菌主要是肠杆菌科,肠球菌属和葡萄球菌属。微生物群落组成之间的大多数差异可归因于婴儿样本的来源,而临床状态(健康坏死性,小肠结肠炎或迟发性败血症)和新生儿重症监护病房(NICU)的时间对细菌组成没有显着影响。粪便代谢组也被发现是个体独有的,与细菌组成微弱相关。测定的代谢产物未发现与坏死性小肠结肠炎,迟发性败血症或健康结果有关。总体而言,早产婴儿肠道微生物群落是个性化的,且受抗生素的使用调节,导致抗生素抗性兼性厌氧菌(如肠球菌属)的定殖优势。

亮点

本文对无菌医院环境中早产婴儿,在抗生素频繁使用的前提下,微生物定殖的情况研究,有利于对抗生素使用及其健康后果的有初步理解。

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