文献信息
英文题目：A Metagenomic Study of the Gut Microbiome in Behcet’s Disease
中文题目：白塞病患者肠道微生物的宏基因组研究
发表期刊：Microbiome
发表时间：2018 影响因子：9.133
发表单位：重庆医科大学附属第一医院
测序产品：宏基因组测序，16S扩增子测序
测序平台：Illumina HiSeq；Illumina MiSeq
检索：doi.org/10.1186/s40168-018-0520-6
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研究背景
白塞病（Behcet’s disease ，BD）是一种多器官受累的自身炎症性疾病，以反复发作的口腔及生殖器溃疡、皮肤损害及葡萄膜炎为典型的临床表现。BD多发生于青壮年，炎症反复、治疗棘手，所致的盲目多为不可逆盲，严重影响患者的生存质量。
以往研究发现，遗传因素及自身炎症反应参与BD的发病。BD患者体内Th1及Th17细胞过度激活，调节性T细胞（Treg细胞）数量及功能异常。
近期有研究表明肠道微生物在调节Th1，Th17和Treg细胞中起到至关重要的作用，且肠道微生物紊乱与许多自身免疫性疾病如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等有关，与BD也有关。
然而，之前的研究基于16S扩增子测序分析，有一定的局限性，例如由于扩增子偏倚造成的微生物组成偏差以及16S测序技术鉴定不到菌种和菌株水平的局限。
为了更全面的研究BD患者微生物的组成，文章中采用宏基因组的测序技术研究BD患者和健康人肠道菌群组成的差异，结果表明BD患者和健康人的肠道微生物组成有明显不同。利用粪菌移植的技术将患者的粪便菌群移植到葡萄膜炎动物模型中，使得动物模型的眼部症状加重。基于以上研究，文章建立了一个解释肠道菌群组成和BD发病机制的模型。
研究内容及技术路线
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研究对象
32个BD患者，除了局部使用皮质类固醇滴眼液和睫状肌麻痹剂，没有接受全身药物治疗至少一个月；74个在年龄、性别和BMI较为匹配的健康人。
研究对象排除标准
患有心血管疾病、糖尿病、其他炎症性疾病以及传染病的对象除外，患者一个月内没有服用抗生素或者益生菌。
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研究结果
3.1
肠道微生物组成在BD患者中的变化
收集24个BD患者和52个健康人的粪便样本，进行宏基因组测序，结果发现拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门在患者和健康组中都是主要菌群。有96个属和23个种的丰度在BD组和健康组中有差异。
多达96个属在BD患者中富集，包括38个Ascomycota真菌门，15个Proteobacteria细菌门和15个Actinobacteria细菌门。有5个属在健康组中富集，其中两个是产甲烷菌属（Methanoculleus和Methanomethylophilus）。
在种水平，有23个菌种在BD患者中富集，这些菌种里有一些是条件致病菌，例如Stenotrophomonas spp.、Actinomyces spp.和Corynebacterium spp.（图1）。
结果显示BD患者的肠道菌群组成与健康人有明显差异。有趣的是，无论是在属水平还是种水平，真菌的差异都是显著存在的（96个差异属有49个属于真菌，23个差异种有16个属于真菌）。
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图1. 门水平、属水平和种水平BD患者和健康人差异物种展示
进一步研究BD患者和健康人肠道菌群的差异，使用LEfSe分析，结果发现硫酸盐还原细菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）Bilophila spp.和条件致病菌Parabacteroidesspp.、Paraprevotella spp.和Fusobacterium spp.在BD患者中显著富集，而产甲烷菌Methanoculleus spp.和Methanomethylophilus spp.以及产丁酸盐细菌（butyrate-producing bacteria，BPB）Clostridium spp.在健康组中富集（图2a）。对健康组和BD组富集的微生物进行SparCC网络相关性分析，结果显示在BD组中富集的微生物与健康组中富集的微生物之间呈负相关关系，组内富集细菌之间呈正相关关系（图2b）。
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图2. LEfSe分析BD患者和健康人种水平上微生物的差异
3.2
BD患者的差异基因聚类分析（MGS）
MGS（菌株水平）用来分析BD患者和健康人菌群的差异，结果发现共有17896个微生物基因在BD患者和健康组中差异显著，确定到了13个差异的MGSs，其中11个在BD组中富集，2个在健康组中富集。12个MGSs可以注释到已知物种。在BD组中富集的MGSs来自于Bilophila属、Alistipes属、Paraprevotella属和Faecalibacterium prausnitzii种，其中Bilophila属于SRB，Paraprevotella属于条件致病菌。Clostridium sp. CAG:127在健康组中富集，属于BPB（图3）。基于这13个MGSs作为微生物标记构建能够区分BD患者与健康者的疾病监测模型，AUC=81.1%（95%CI=70-92%）（图3d）。
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图3. MGS分析及BD患者的疾病监测模型构建
3.3
BD患者肠道菌群功能的改变
LEfSe分析肠道菌群组成改变对某些特定功能基因的影响，结果发现25个KEGG中的KO和13个eggNOG中的OG在患者组和健康组中有显著差异。与氧化还原过程相关的KO和OG在BD患者中增加，而在BD中降低的KO与溶菌酶有关，溶菌酶因降解细胞壁中的肽聚糖而具有消炎作用。在KEGG module水平，BD患者中的荚膜多糖运输系统、types III和types IV分泌系统显著增强。
3.4
BD患者口腔中微生物组成的改变
口腔溃疡反复发作是BD患者常见的临床症状之一。为了研究BD患者的口腔微生物组成与肠道菌群组成之间的关系，对15个BD患者和43个健康人的唾液样本进行16S扩增子测序分析，结果显示双歧杆菌目Bifidobacteriales在BD患者中富集，属水平上Bifidobacterium、Prevotella和Scardovia也在BD患者中富集，这与LEfSe分析中的结果一致。这些结果显示BD患者的口腔微生物组成也发生了变化。
3.5
粪菌移植在EAU小鼠中的效果
上述实验已经证明肠道菌群组成和功能在BD患者和健康者之间有差异。我们使用动物模型进一步研究BD患者的粪便菌群是否影响或加重小鼠葡萄膜炎的病情。分别移植5个BD患者和5个健康人混合的粪便到经过抗生素处理的B10RIII小鼠中，粪菌移植后取小鼠的结肠内容物进行16S测序，结果发现粪菌定植的小鼠与无定植的小鼠相比较，微生物多样性显著提高，而且微生物功能也有显著差异。重要的是，我们发现Bilophila、Alistipes和Paraprevotella在BD移植组中显著富集，和BD患者肠道微生物MGS的结果一致。
粪菌移植后，利用IRBP诱导受体小鼠发生葡萄膜炎，14天后，比较BD患者和健康人粪菌移植的小鼠的临床组织学评分和脾脏中BD相关细胞因子的表达。结果发现在BD受体组，小鼠葡萄膜炎的症状加重，可见明显的睫状充血、角膜水肿、虹膜后粘连等，临床评分2-4.5分（图4a）。在健康受体组和PBS对照组中只观察到轻微的结膜充血或混合充血，临床评分为0-1.5分（图4b,c）。与健康受体组和PBS对照组小鼠相比较，BD受体组小鼠临床表现更为严重（图4g，p=0.012）。组织学分析结果显示BD受体组小鼠的视网膜结构严重紊乱，大量炎症细胞浸润（图4d）。相比之下，健康受体组和PBS对照组小鼠仅在玻璃体腔内观察到了少许渗出的炎症细胞（图4e,f）。病理评分也说明BD受体组眼内炎症的严重程度显著高于健康受体组和对照组（图4h, both p=0.002）。BD受体组中IL-17 和 IFN-γ mRNA的表达量也显著高于健康受体组（图4i,j，IL-17, p < 0.001; IFN-γ, p = 0.009）和PBS对照组（图4i,j，IL-17, p = 0.006; IFN-γ, p = 0.014）。
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图4. BD患者和健康人粪菌移植在小鼠实验中的结果
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讨论
BD患者的肠道微生物失调的特点是SRB和条件致病菌富集，BPB和产甲烷菌减少。BD患者肠道微生物SRB的富集可能导致硫化氢的过度产生，而BPB和产甲烷菌的减少可能导致其代谢产物丁酸盐和甲烷减少，这种异常的肠内微环境可能损伤肠上皮和/或血管内皮细胞，损害其屏障功能；另一方面，由于条件致病菌在病人肠道的富集，其效应分子和病原体相关模式分子PAMP（pathogen-associated molecular pattern）侵入肠上皮细胞和/或血管内皮细胞，被模式识别受体TLR2/TLR4识别，诱导Th1和Th17过度活化，从而导致导致肠道和/或血管炎症，并最终导致了导致了BD的发生。
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图5. 肠道微生物组成和白塞病发病机制之间可能的关系
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文章亮点
BD患者和健康人肠道菌群比较，发现了一些条件致病菌和SRB在BD患者的肠道中富集，同时BPB和产甲烷菌在健康者的肠道富集；另外人肠道MGS的分析结果与小鼠菌群移植的结果一致，分析结果吻合度高；
基于宏基因组MGS的结果，在菌株水平上构建了BD的疾病监测模型；
利用EAU小鼠模型确定了BD患者粪便菌群可以加重EAU小鼠的眼炎症状，并采用RT-PCR确定了BD受体小鼠中的IL-17和IFN-γ细胞因子的表达增加。
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宏基因组测序采用最新的Illumina Hiseq平台，并具有以下优势：
■ 全面的技术策略：采用Illmina Hiseq平台，测序策略为PE150。对测序序列组装，得到微生物群落结构的基因信息，分析微生物群落结构的基因、功能基因及物种多样性，探讨微生物群落与宿主之间的相互关系等。
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