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2018-08-08浏览量:2766

白塞病患者肠道微生物的宏基因组研究

文献信息

                                                                   英文题目:A Metagenomic Study of the Gut Microbiome in Behcet’s Disease

                                                                                                                 中文题目:白塞病患者肠道微生物的宏基因组研究

                                                                                                                发表期刊:Microbiome

                                                                                                                发表时间:2018    影响因子:9.133

                                                                                                                发表单位:重庆医科大学附属第一医院

                                                                                                                测序产品:宏基因组测序,16S扩增子测序

                                                                                                                测序平台:Illumina HiSeq;Illumina MiSeq

                                                                                                                检索:doi.org/10.1186/s40168-018-0520-6

                                                                                                                点击文末“阅读原文”,可转至文献下载页面

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研究背景

白塞病(Behcet’s disease ,BD)是一种多器官受累的自身炎症性疾病,以反复发作的口腔及生殖器溃疡、皮肤损害及葡萄膜炎为典型的临床表现。BD多发生于青壮年,炎症反复、治疗棘手,所致的盲目多为不可逆盲,严重影响患者的生存质量。

 以往研究发现,遗传因素及自身炎症反应参与BD的发病。BD患者体内Th1及Th17细胞过度激活,调节性T细胞(Treg细胞)数量及功能异常。

近期有研究表明肠道微生物在调节Th1,Th17和Treg细胞中起到至关重要的作用,且肠道微生物紊乱与许多自身免疫性疾病如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等有关,与BD也有关。

然而,之前的研究基于16S扩增子测序分析,有一定的局限性,例如由于扩增子偏倚造成的微生物组成偏差以及16S测序技术鉴定不到菌种和菌株水平的局限。

为了更全面的研究BD患者微生物的组成,文章中采用宏基因组的测序技术研究BD患者和健康人肠道菌群组成的差异,结果表明BD患者和健康人的肠道微生物组成有明显不同。利用粪菌移植的技术将患者的粪便菌群移植到葡萄膜炎动物模型中,使得动物模型的眼部症状加重。基于以上研究,文章建立了一个解释肠道菌群组成和BD发病机制的模型。

研究内容及技术路线

研究对象

32个BD患者,除了局部使用皮质类固醇滴眼液和睫状肌麻痹剂,没有接受全身药物治疗至少一个月;74个在年龄、性别和BMI较为匹配的健康人。

研究对象排除标准

患有心血管疾病、糖尿病、其他炎症性疾病以及传染病的对象除外,患者一个月内没有服用抗生素或者益生菌。

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研究结果

3.1

肠道微生物组成在BD患者中的变化

收集24个BD患者和52个健康人的粪便样本,进行宏基因组测序,结果发现拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门在患者和健康组中都是主要菌群。有96个属和23个种的丰度在BD组和健康组中有差异。

多达96个属在BD患者中富集,包括38个Ascomycota真菌门,15个Proteobacteria细菌门和15个Actinobacteria细菌门。有5个属在健康组中富集,其中两个是产甲烷菌属(MethanoculleusMethanomethylophilus)。

在种水平,有23个菌种在BD患者中富集,这些菌种里有一些是条件致病菌,例如Stenotrophomonas spp.、Actinomyces spp.和Corynebacterium spp.(图1)。

结果显示BD患者的肠道菌群组成与健康人有明显差异。有趣的是,无论是在属水平还是种水平,真菌的差异都是显著存在的(96个差异属有49个属于真菌,23个差异种有16个属于真菌)。

图1. 门水平、属水平和种水平BD患者和健康人差异物种展示

进一步研究BD患者和健康人肠道菌群的差异,使用LEfSe分析,结果发现硫酸盐还原细菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)Bilophila spp.和条件致病菌Parabacteroidesspp.、Paraprevotella spp.和Fusobacterium spp.在BD患者中显著富集,而产甲烷菌Methanoculleus spp.和Methanomethylophilus spp.以及产丁酸盐细菌(butyrate-producing bacteria,BPB)Clostridium spp.在健康组中富集(图2a)。对健康组和BD组富集的微生物进行SparCC网络相关性分析,结果显示在BD组中富集的微生物与健康组中富集的微生物之间呈负相关关系,组内富集细菌之间呈正相关关系(图2b)。

图2. LEfSe分析BD患者和健康人种水平上微生物的差异

3.2

BD患者的差异基因聚类分析(MGS)

MGS(菌株水平)用来分析BD患者和健康人菌群的差异,结果发现共有17896个微生物基因在BD患者和健康组中差异显著,确定到了13个差异的MGSs,其中11个在BD组中富集,2个在健康组中富集。12个MGSs可以注释到已知物种。在BD组中富集的MGSs来自于Bilophila属、Alistipes属、Paraprevotella属和Faecalibacterium prausnitzii种,其中Bilophila属于SRB,Paraprevotella属于条件致病菌。Clostridium sp. CAG:127在健康组中富集,属于BPB(图3)。基于这13个MGSs作为微生物标记构建能够区分BD患者与健康者的疾病监测模型,AUC=81.1%(95%CI=70-92%)(图3d)。

图3. MGS分析及BD患者的疾病监测模型构建

 3.3

BD患者肠道菌群功能的改变

 LEfSe分析肠道菌群组成改变对某些特定功能基因的影响,结果发现25个KEGG中的KO和13个eggNOG中的OG在患者组和健康组中有显著差异。与氧化还原过程相关的KO和OG在BD患者中增加,而在BD中降低的KO与溶菌酶有关,溶菌酶因降解细胞壁中的肽聚糖而具有消炎作用。在KEGG module水平,BD患者中的荚膜多糖运输系统、types III和types IV分泌系统显著增强。

3.4

BD患者口腔中微生物组成的改变

口腔溃疡反复发作是BD患者常见的临床症状之一。为了研究BD患者的口腔微生物组成与肠道菌群组成之间的关系,对15个BD患者和43个健康人的唾液样本进行16S扩增子测序分析,结果显示双歧杆菌目Bifidobacteriales在BD患者中富集,属水平上BifidobacteriumPrevotellaScardovia也在BD患者中富集,这与LEfSe分析中的结果一致。这些结果显示BD患者的口腔微生物组成也发生了变化。

3.5

粪菌移植在EAU小鼠中的效果

上述实验已经证明肠道菌群组成和功能在BD患者和健康者之间有差异。我们使用动物模型进一步研究BD患者的粪便菌群是否影响或加重小鼠葡萄膜炎的病情。分别移植5个BD患者和5个健康人混合的粪便到经过抗生素处理的B10RIII小鼠中,粪菌移植后取小鼠的结肠内容物进行16S测序,结果发现粪菌定植的小鼠与无定植的小鼠相比较,微生物多样性显著提高,而且微生物功能也有显著差异。重要的是,我们发现BilophilaAlistipesParaprevotella在BD移植组中显著富集,和BD患者肠道微生物MGS的结果一致。

粪菌移植后,利用IRBP诱导受体小鼠发生葡萄膜炎,14天后,比较BD患者和健康人粪菌移植的小鼠的临床组织学评分和脾脏中BD相关细胞因子的表达。结果发现在BD受体组,小鼠葡萄膜炎的症状加重,可见明显的睫状充血、角膜水肿、虹膜后粘连等,临床评分2-4.5分(图4a)。在健康受体组和PBS对照组中只观察到轻微的结膜充血或混合充血,临床评分为0-1.5分(图4b,c)。与健康受体组和PBS对照组小鼠相比较,BD受体组小鼠临床表现更为严重(图4g,p=0.012)。组织学分析结果显示BD受体组小鼠的视网膜结构严重紊乱,大量炎症细胞浸润(图4d)。相比之下,健康受体组和PBS对照组小鼠仅在玻璃体腔内观察到了少许渗出的炎症细胞(图4e,f)。病理评分也说明BD受体组眼内炎症的严重程度显著高于健康受体组和对照组(图4h, both p=0.002)。BD受体组中IL-17 和 IFN-γ mRNA的表达量也显著高于健康受体组(图4i,j,IL-17, p < 0.001; IFN-γ, p = 0.009)和PBS对照组(图4i,j,IL-17, p = 0.006; IFN-γ, p = 0.014)。

图4. BD患者和健康人粪菌移植在小鼠实验中的结果

4

 讨论 

BD患者的肠道微生物失调的特点是SRB和条件致病菌富集,BPB和产甲烷菌减少。BD患者肠道微生物SRB的富集可能导致硫化氢的过度产生,而BPB和产甲烷菌的减少可能导致其代谢产物丁酸盐和甲烷减少,这种异常的肠内微环境可能损伤肠上皮和/或血管内皮细胞,损害其屏障功能;另一方面,由于条件致病菌在病人肠道的富集,其效应分子和病原体相关模式分子PAMP(pathogen-associated molecular pattern)侵入肠上皮细胞和/或血管内皮细胞,被模式识别受体TLR2/TLR4识别,诱导Th1和Th17过度活化,从而导致导致肠道和/或血管炎症,并最终导致了导致了BD的发生。

图5. 肠道微生物组成和白塞病发病机制之间可能的关系

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文章亮点

BD患者和健康人肠道菌群比较,发现了一些条件致病菌和SRB在BD患者的肠道中富集,同时BPB和产甲烷菌在健康者的肠道富集;另外人肠道MGS的分析结果与小鼠菌群移植的结果一致,分析结果吻合度高;

基于宏基因组MGS的结果,在菌株水平上构建了BD的疾病监测模型;

利用EAU小鼠模型确定了BD患者粪便菌群可以加重EAU小鼠的眼炎症状,并采用RT-PCR确定了BD受体小鼠中的IL-17和IFN-γ细胞因子的表达增加。

公海赌船网址基因服务

宏基因组测序采用最新的Illumina Hiseq平台,并具有以下优势:

■ 全面的技术策略:采用Illmina Hiseq平台,测序策略为PE150。对测序序列组装,得到微生物群落结构的基因信息,分析微生物群落结构的基因、功能基因及物种多样性,探讨微生物群落与宿主之间的相互关系等。

■ 更合理的分析方法:增加了最前沿的CAG和MGS等宏基因组分析方法,深入挖掘样品中的信息。

■ 多选择的功能基因注释数据库:KEGG、eggNOG、CAZY、ARDB、SEED等。

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